目(mu)前SARS-CoV-2臨床(chuang)試驗用脂(zhi)質納(na)米顆粒的開(kai)發

mRNA最(zui)早的(de)(de)(de)(de)轉染試(shi)劑是(shi)季(ji)銨(an)化(hua)(hua)陽(yang)離(li)(li)(li)(li)子(zi)DOTAP結合(he)可電(dian)離(li)(li)(li)(li)和(he)融(rong)(rong)合(he)的(de)(de)(de)(de)DOPE，采用DNA轉染[85]，用于(yu)在(zai)眾多細胞類型(xing)中(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)轉染mRNA[86]。盡管(guan)在(zai)體外有效，但永久性(xing)陽(yang)離(li)(li)(li)(li)子(zi)季(ji)銨(an)基(ji)(ji)團(tuan)使(shi)這(zhe)些(xie)大尺寸的(de)(de)(de)(de)脂(zhi)復合(he)物從(cong)循環和(he)其(qi)通常靶器官(guan)肺中(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)迅速清除，并表現出(chu)毒(du)性(xing)。今(jin)天LNP的(de)(de)(de)(de)先驅是(shi)穩(wen)(wen)定(ding)的(de)(de)(de)(de)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)粒-脂(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)顆(ke)粒(SPLP)，它(ta)是(shi)由(you)融(rong)(rong)合(he)基(ji)(ji)因(yin)電(dian)離(li)(li)(li)(li)的(de)(de)(de)(de)DOPE與季(ji)銨(an)化(hua)(hua)的(de)(de)(de)(de)陽(yang)離(li)(li)(li)(li)子(zi)脂(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)DODAC結合(he)形成(cheng)的(de)(de)(de)(de)，DODAC靜電(dian)結合(he)并包(bao)裹質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)粒DNA，然后(hou)用親(qin)水性(xing)PEG包(bao)被，使(shi)其(qi)在(zai)水介質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)中(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)穩(wen)(wen)定(ding)，并在(zai)體內(nei)(nei)給藥時限(xian)制蛋白質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)和(he)細胞相互作用[87]。DOPE在(zai)細胞攝取(qu)后(hou)可在(zai)內(nei)(nei)涵(han)(han)體中(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)子(zi)化(hua)(hua)，由(you)于(yu)呈錐形，因(yin)此可與內(nei)(nei)涵(han)(han)體磷脂(zhi)形成(cheng)內(nei)(nei)體溶(rong)解離(li)(li)(li)(li)子(zi)對，以(yi)促進(jin)內(nei)(nei)涵(han)(han)體釋放，這(zhe)是(shi)成(cheng)功遞送的(de)(de)(de)(de)關鍵事件[17]。然后(hou)進(jin)一步將(jiang)SPLP開發(fa)(fa)為(wei)含有siRNA的(de)(de)(de)(de)穩(wen)(wen)定(ding)核酸脂(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)顆(ke)粒(SNALP)，包(bao)括四種(zhong)脂(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)：離(li)(li)(li)(li)子(zi)化(hua)(hua)而不是(shi)季(ji)銨(an)化(hua)(hua)陽(yang)離(li)(li)(li)(li)子(zi)脂(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)、飽和(he)雙層(ceng)形成(cheng)季(ji)銨(an)化(hua)(hua)兩性(xing)離(li)(li)(li)(li)子(zi)脂(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)、DSPC、膽固醇(chun)和(he)PEG脂(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)[88]。除了與核酸靜電(dian)結合(he)外，SNALPs中(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)的(de)(de)(de)(de)可電(dian)離(li)(li)(li)(li)脂(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)發(fa)(fa)揮了融(rong)(rong)合(he)脂(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)的(de)(de)(de)(de)作用，并在(zai)內(nei)(nei)涵(han)(han)體中(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)子(zi)化(hua)(hua)，與內(nei)(nei)涵(han)(han)體磷脂(zhi)形成(cheng)膜不穩(wen)(wen)定(ding)離(li)(li)(li)(li)子(zi)對。目前已知DSPC有助于(yu)在(zai)PEG表面下(xia)形成(cheng)穩(wen)(wen)定(ding)的(de)(de)(de)(de)雙層(ceng)[89]。膽固醇(chun)發(fa)(fa)揮多種(zhong)作用，包(bao)括填補顆(ke)粒間隙、限(xian)制LNP–蛋白質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)相互作用和(he)可能(neng)促進(jin)膜融(rong)(rong)合(he)[90]。可電(dian)離(li)(li)(li)(li)脂(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)在(zai)生理pH下(xia)呈中(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)性(xing)，從(cong)而消除循環中(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)的(de)(de)(de)(de)任(ren)何陽(yang)離(li)(li)(li)(li)子(zi)電(dian)荷，但在(zai)pH~6.5的(de)(de)(de)(de)內(nei)(nei)體中(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)子(zi)化(hua)(hua)，促進(jin)內(nei)(nei)體釋放，發(fa)(fa)揮核心作用。

2018年(nian)臨床批(pi)準的(de)(de)(de)(de)(de)(de)首個siRNA產品的(de)(de)(de)(de)(de)(de)開發主要集中(zhong)在(zai)(zai)優化可電離(li)(li)脂質，其次是(shi)PEG脂質和LNP中(zhong)使用的(de)(de)(de)(de)(de)(de)四種脂質的(de)(de)(de)(de)(de)(de)比例，以及LNP組(zu)裝和生產程序。根(gen)據分子形狀假設[12,91]，發現(xian)C18尾中(zhong)不(bu)飽和鍵的(de)(de)(de)(de)(de)(de)最佳數量(liang)是(shi)通過(guo)(guo)(guo)醚(mi)連(lian)接到二甲胺頭基(ji)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)二亞(ya)油(you)(you)酸尾[88]。然而，在(zai)(zai)亞(ya)油(you)(you)酸尾部引入(ru)單個連(lian)接體，其具有(you)從(cong)二甲胺頭基(ji)到連(lian)接體的(de)(de)(de)(de)(de)(de)優化碳數，導致LNP中(zhong)可電離(li)(li)脂質DLin-MC3-DMA的(de)(de)(de)(de)(de)(de)pKa接近6.4[92,93]。優化的(de)(de)(de)(de)(de)(de)最后(hou)一步(bu)是(shi)將MC3/DSPC/膽固醇(chun)/PEG–脂質的(de)(de)(de)(de)(de)(de)這些脂質摩(mo)爾比調節至50/10/38.5/1.5。總體從(cong)DLin-DMA到DLin-MC3-DMA的(de)(de)(de)(de)(de)(de)這一優化過(guo)(guo)(guo)程需(xu)要在(zai)(zai)數千種制劑中(zhong)篩選超過(guo)(guo)(guo)300種可電離(li)(li)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)脂質，并導致效(xiao)價增加200倍和有(you)效(xiao)劑量(liang)相應減少，以實現(xian)對靶基(ji)因(yin)> 80%的(de)(de)(de)(de)(de)(de)持久抑制和允許治療窗，2018年(nian)Onpattro™獲(huo)得臨床批(pi)準[94,95]。這種為siRNA開發的(de)(de)(de)(de)(de)(de)MC3配(pei)方是(shi)隨后(hou)開發LNPs的(de)(de)(de)(de)(de)(de)基(ji)礎，如下所述（圖(tu)1），在(zai)(zai)被批(pi)準用于(yu)SARS-CoV-2 mRNA疫苗(miao)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)遞(di)送后(hou)，LNPs現(xian)在(zai)(zai)正被緊急使用。

圖1 mRNA脂質(zhi)納(na)米顆(ke)粒(li)結(jie)構。最近使用冷凍電子(zi)顯微鏡[96]、小角中(zhong)子散(san)射和小角X射線(xian)散射[89]進行的研究表明，mRNA脂(zhi)質納米顆粒(li)包括低拷(kao)貝(bei)數的mRNA(1-10)，并(bing)且mRNA與占據(ju)LNP中心核心的可電離脂(zhi)質結合(he)。聚乙二醇(PEG)脂(zhi)(zhi)質形成(cheng)脂(zhi)(zhi)質納米顆(ke)粒(LNP)的表面(mian)，同時形成雙(shuang)層的DSPC。帶(dai)(dai)電(dian)荷和不帶(dai)(dai)電(dian)荷的膽(dan)固(gu)醇和可電(dian)離脂質(zhi)可分(fen)布在(zai)整個LNP中。其他輸送系統的結構示意圖在最近的綜述中提供[14]。

Moderna使用上述Onpattro制(zhi)劑(ji)中(zhong)(zhong)的(de)MC3進行了幾項臨(lin)床(chuang)前(qian)[97,98,99]和臨(lin)床(chuang)研究[97,100]，以遞(di)送核苷修飾的(de)mRNA編碼免疫原(yuan)。在這(zhe)些比較新(xin)的(de)一類可(ke)電離脂(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)與MC3的(de)研究中(zhong)(zhong)，MC3后(hou)來(lai)被確定為可(ke)電離脂(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)[42,101]。這(zhe)個(ge)新(xin)類別包括Lipid H[42]，它是Moderna的(de)SARS-CoV-2產品(pin)mRNA-1273中(zhong)(zhong)的(de)可(ke)電離脂(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)SM-102[41]（表2）。

使用(yong)針對(dui)寨卡病(bing)毒的(de)(de)核(he)苷修(xiu)飾(shi)的(de)(de)mRNA編碼(ma)(ma)免(mian)(mian)疫(yi)(yi)原，MC3 LNP能夠(gou)(gou)保(bao)護缺乏I型和(he)II型干擾素(IFN)信號的(de)(de)免(mian)(mian)疫(yi)(yi)功能低(di)下(xia)小(xiao)(xiao)鼠(shu)免(mian)(mian)受(shou)(shou)10µg劑(ji)量1次(ci)(ci)(ci)(ci)或2µg劑(ji)量初免(mian)(mian)-加強免(mian)(mian)疫(yi)(yi)設計(ji)(ji)的(de)(de)致(zhi)死攻(gong)擊(ji)[99]。在(zai)預先(xian)給(gei)予抗(kang)(kang)ifnar1阻斷(duan)抗(kang)(kang)體以建立(li)致(zhi)死模(mo)型的(de)(de)免(mian)(mian)疫(yi)(yi)功能正(zheng)常小(xiao)(xiao)鼠(shu)中(zhong)也(ye)獲得了(le)(le)相似(si)的(de)(de)結果。在(zai)一(yi)系列(lie)遞送核(he)苷修(xiu)飾(shi)的(de)(de)mRNA編碼(ma)(ma)血凝素(HA)免(mian)(mian)疫(yi)(yi)原的(de)(de)流(liu)感研(yan)究(jiu)中(zhong)，皮(pi)內(nei)遞送的(de)(de)MC3 LNP能夠(gou)(gou)完全保(bao)護小(xiao)(xiao)鼠(shu)免(mian)(mian)受(shou)(shou)低(di)至0.4µg單(dan)次(ci)(ci)(ci)(ci)給(gei)藥的(de)(de)致(zhi)死性(xing)攻(gong)擊(ji)，盡(jin)管即使單(dan)次(ci)(ci)(ci)(ci)給(gei)予高達10µg劑(ji)量，攻(gong)毒后也(ye)會出現體重(zhong)(zhong)減輕(qing)[97]。雪貂(diao)單(dan)次(ci)(ci)(ci)(ci)給(gei)予50µg或100µg劑(ji)量產(chan)生(sheng)了(le)(le)較(jiao)高的(de)(de)HAI（血凝抑制試驗(yan)）滴度，非人(ren)靈長類動物(wu)單(dan)次(ci)(ci)(ci)(ci)給(gei)予200或400µg劑(ji)量也(ye)產(chan)生(sheng)了(le)(le)較(jiao)高的(de)(de)HAI滴度。在(zai)接受(shou)(shou)100µg劑(ji)量的(de)(de)少數(shu)(23)人(ren)類受(shou)(shou)試者中(zhong)，在(zai)研(yan)究(jiu)開(kai)始時，所有受(shou)(shou)試者的(de)(de)HAI滴度均(jun) > 40（who保(bao)護相關性(xing)），比基線高4倍(bei)以上。在(zai)一(yi)項更(geng)大規模(mo)的(de)(de)1期試驗(yan)中(zhong)，使用(yong)相同的(de)(de)MC3 LNPs遞送兩種不(bu)同的(de)(de)核(he)苷修(xiu)飾(shi)的(de)(de)mRNA編碼(ma)(ma)的(de)(de)HA免(mian)(mian)疫(yi)(yi)原，肌肉注(zhu)射100µg的(de)(de)H10N8免(mian)(mian)疫(yi)(yi)原導致(zhi)23名受(shou)(shou)試者中(zhong)100%的(de)(de)HAI滴度 > 40[100]。盡(jin)管未發(fa)生(sheng)危及生(sheng)命的(de)(de)不(bu)良(liang)事(shi)(shi)件(jian)(jian)，但這(zhe)23例(li)(li)(li)受(shou)(shou)試者中(zhong)有3例(li)(li)(li)發(fa)生(sheng)了(le)(le)重(zhong)(zhong)度3級不(bu)良(liang)事(shi)(shi)件(jian)(jian)。3例(li)(li)(li)受(shou)(shou)試者中(zhong)的(de)(de)2例(li)(li)(li)發(fa)生(sheng)3級不(bu)良(liang)事(shi)(shi)件(jian)(jian)（符合研(yan)究(jiu)暫(zan)停(ting)規則）后，停(ting)止計(ji)(ji)劃(hua)的(de)(de)400µg給(gei)藥。在(zai)較(jiao)低(di)劑(ji)量下(xia)，不(bu)良(liang)事(shi)(shi)件(jian)(jian)的(de)(de)頻率和(he)嚴重(zhong)(zhong)程度降低(di)，但幾乎每例(li)(li)(li)受(shou)(shou)試者均(jun)發(fa)生(sheng)至少1起不(bu)良(liang)事(shi)(shi)件(jian)(jian)。這(zhe)些研(yan)究(jiu)很(hen)有前(qian)(qian)景，但也(ye)強調(diao)了(le)(le)在(zai)不(bu)會引起問題數(shu)量的(de)(de)不(bu)良(liang)事(shi)(shi)件(jian)(jian)的(de)(de)劑(ji)量下(xia)獲得保(bao)護性(xing)免(mian)(mian)疫(yi)(yi)的(de)(de)治療(liao)窗相對(dui)較(jiao)窄(zhai)。這(zhe)讓人(ren)想起MC3前(qian)(qian)體DLin-DMA的(de)(de)治療(liao)窗窄(zhai)，需要提高效(xiao)力才能降低(di)劑(ji)量，仍(reng)然(ran)實(shi)現有效(xiao)的(de)(de)基因敲低(di)。

表2脂(zhi)質納米顆(ke)粒(li)中使用(yong)(yong)的(de)可電(dian)離脂(zhi)質。脂(zhi)質納米顆(ke)粒(li)中使用(yong)(yong)的(de)可電(dian)離脂(zhi)質的(de)一個關(guan)鍵特征是，通過TNS染(ran)料結合試驗測定，LNP中可電離脂質的pKa應在(zai)6-7范圍內。理論上計算的(de)大多(duo)數可電離基團的(de)pKa在(zai)8-9.5范圍內，如下(xia)所示在氮原(yuan)子上(shang)，使用商業(ye)軟件理論上(shang)估計水(shui)介質中的(de)這(zhe)些值。pKa從理論(lun)值(zhi)下降2-3個點至TNS值是(shi)由于脂相中(zhong)質子的溶劑化能量更高，導致脂相中(zhong)的pH值比水相高(gao)2-3個點(dian)，在TNS測(ce)定(ding)期間測(ce)量pH值[102]。

由于siRNA產(chan)品需要重復給(gei)藥(yao)(yao)治療慢(man)性(xing)疾病，人(ren)們擔心MC3中(zhong)(zhong)(zhong)二亞(ya)油酸烷基(ji)尾的(de)(de)(de)(de)緩慢(man)降(jiang)解會導致重復給(gei)藥(yao)(yao)的(de)(de)(de)(de)蓄(xu)積和潛(qian)在毒性(xing)。MC3的(de)(de)(de)(de)生物(wu)可(ke)(ke)降(jiang)解版本脂(zhi)質(zhi)(zhi)319（表2）是通過(guo)用在體內(nei)易于被酯(zhi)(zhi)酶降(jiang)解的(de)(de)(de)(de)伯(bo)酯(zhi)(zhi)取代每個(ge)烷基(ji)鏈中(zhong)(zhong)(zhong)兩(liang)個(ge)雙鍵中(zhong)(zhong)(zhong)的(de)(de)(de)(de)一個(ge)而(er)(er)產(chan)生的(de)(de)(de)(de)[68]。觀察到脂(zhi)質(zhi)(zhi)319在肝臟中(zhong)(zhong)(zhong)的(de)(de)(de)(de)半衰期小于1小時(shi)，而(er)(er)其在肝臟中(zhong)(zhong)(zhong)保持與MC3相(xiang)似(si)的(de)(de)(de)(de)基(ji)因沉默效率(lv)。在體內(nei)證實了(le)降(jiang)解產(chan)物(wu)，以及其分泌和脂(zhi)質(zhi)(zhi)319的(de)(de)(de)(de)無毒性(xing)質(zhi)(zhi)。在SARS-CoV-2的(de)(de)(de)(de)臨床前和臨床研究中(zhong)(zhong)(zhong)引用了(le)脂(zhi)質(zhi)(zhi)319的(de)(de)(de)(de)研究，作為(wei)BioNTech[49]和CureVac[53,69]產(chan)品中(zhong)(zhong)(zhong)使用的(de)(de)(de)(de)Acuitas LNP類別，盡管在倫敦帝國理工學院試(shi)驗[60]中(zhong)(zhong)(zhong)Acuitas LNP遞送的(de)(de)(de)(de)自(zi)擴增RNA被引用為(wei)包含在最近的(de)(de)(de)(de)專(zhuan)利申請(qing)中(zhong)(zhong)(zhong)[59]，這里(li)由Acuitas的(de)(de)(de)(de)Lipid A9代表（表2）。最近，BioNTech批準的(de)(de)(de)(de)BNT162b2中(zhong)(zhong)(zhong)Acuitas可(ke)(ke)電離脂(zhi)質(zhi)(zhi)的(de)(de)(de)(de)同一性(xing)被披露為(wei)ALC-0315[40]（表2）。這些LNPs的(de)(de)(de)(de)一個(ge)重要方(fang)面是，它們是通過(guo)篩選IV給(gei)藥(yao)(yao)后肝臟中(zhong)(zhong)(zhong)的(de)(de)(de)(de)mRNA表達(da)而(er)(er)開發的(de)(de)(de)(de)，可(ke)(ke)能還沒有完(wan)全優化用于基(ji)于mRNA的(de)(de)(de)(de)疫苗的(de)(de)(de)(de)肌內(nei)給(gei)藥(yao)(yao)。

Moderna最近開(kai)發(fa)(fa)了一(yi)類(lei)新的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)可(ke)(ke)電(dian)離脂(zhi)(zhi)(zhi)質來替代(dai)MC3，主要(yao)是(shi)(shi)由于上(shang)述(shu)(shu)與(yu)(yu)MC3降(jiang)(jiang)解(jie)緩(huan)慢相關的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)問(wen)題(ti)，但也努(nu)力通過實現比(bi)二亞油(you)酸MC3烷基尾更大(da)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)分(fen)支來提高其效(xiao)(xiao)(xiao)力[42,101]。這(zhe)類(lei)新脂(zhi)(zhi)(zhi)質具有(you)(you)乙醇胺可(ke)(ke)電(dian)離頭基，與(yu)(yu)含(han)有(you)(you)一(yi)級(ji)(ji)降(jiang)(jiang)解(jie)酯(zhi)(zhi)（如(ru)Maier 2013）的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)單(dan)個(ge)飽(bao)和(he)尾連(lian)接，并與(yu)(yu)第二個(ge)飽(bao)和(he)尾連(lian)接，后者(zhe)使用(yong)(yong)降(jiang)(jiang)解(jie)性(xing)(xing)較(jiao)低的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)二級(ji)(ji)酯(zhi)(zhi)在(zai)7個(ge)碳原子(zi)后分(fen)支成(cheng)兩(liang)個(ge)飽(bao)和(he)C8尾，如(ru)脂(zhi)(zhi)(zhi)質5[101]（表(biao)2）。優(you)化用(yong)(yong)于肝(gan)臟(zang)IV給(gei)藥(yao)，發(fa)(fa)現相似(si)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)脂(zhi)(zhi)(zhi)質H[42]或SM-102是(shi)(shi)疫(yi)苗(miao)肌內(nei)(IM)給(gei)藥(yao)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)最佳(jia)選擇。分(fen)支增(zeng)(zeng)加(jia)(jia)(jia)是(shi)(shi)Acuitas追(zhui)求的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)共同特征，因(yin)(yin)為(wei)(wei)Lipid A9共有(you)(you)5個(ge)分(fen)支鏈(lian)[59]（表(biao)2），而Moderna LNPs有(you)(you)3個(ge)分(fen)支鏈(lian)。分(fen)支增(zeng)(zeng)加(jia)(jia)(jia)被認為(wei)(wei)可(ke)(ke)產生具有(you)(you)更多錐(zhui)形結構(gou)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)可(ke)(ke)電(dian)離脂(zhi)(zhi)(zhi)質，因(yin)(yin)此，當與(yu)(yu)內(nei)體(ti)(ti)中(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)陰(yin)離子(zi)磷脂(zhi)(zhi)(zhi)配對(dui)時，將發(fa)(fa)生更大(da)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)膜(mo)破壞能(neng)力，遵循幾十年前概述(shu)(shu)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)分(fen)子(zi)形狀假設(she)[12,91]。當IV給(gei)藥(yao)時，24h時在(zai)肝(gan)臟(zang)中(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)檢(jian)測不到脂(zhi)(zhi)(zhi)質5，而MC3以其初始劑量的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)71%存在(zai)于肝(gan)臟(zang)中(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)，驗(yan)證Lipid 5的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)降(jiang)(jiang)解(jie)性(xing)(xing)。IV給(gei)藥(yao)后，Lipid 5在(zai)小(xiao)鼠(shu)中(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)熒光素(su)酶表(biao)達的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)效(xiao)(xiao)(xiao)力是(shi)(shi)MC3的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)3倍(bei)，在(zai)非人(ren)靈長(chang)(chang)類(lei)動物中(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)hEPO的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)效(xiao)(xiao)(xiao)力是(shi)(shi)MC3的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)5倍(bei)。這(zhe)些(xie)效(xiao)(xiao)(xiao)力的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)增(zeng)(zeng)加(jia)(jia)(jia)與(yu)(yu)胞(bao)內(nei)體(ti)(ti)釋(shi)(shi)放增(zeng)(zeng)加(jia)(jia)(jia)一(yi)致，可(ke)(ke)能(neng)是(shi)(shi)由胞(bao)內(nei)體(ti)(ti)釋(shi)(shi)放增(zeng)(zeng)加(jia)(jia)(jia)引起的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)，對(dui)于Lipid 5，細胞(bao)中(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)高達15%的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)mRNA從(cong)胞(bao)內(nei)體(ti)(ti)釋(shi)(shi)放，而MC3為(wei)(wei)2.5%，后者(zhe)與(yu)(yu)之前使用(yong)(yong)siRNA測定(ding)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)MC3的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)結果(guo)相似(si)[106]。然而，在(zai)這(zhe)些(xie)內(nei)體(ti)(ti)釋(shi)(shi)放實驗(yan)中(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)，MC3的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)細胞(bao)攝(she)取是(shi)(shi)Lipid 5的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)4倍(bei)，因(yin)(yin)此這(zhe)兩(liang)種(zhong)LNPs在(zai)細胞(bao)質中(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)釋(shi)(shi)放的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)mRNA的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)絕對(dui)量相似(si)。在(zai)疫(yi)苗(miao)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)肌內(nei)給(gei)藥(yao)中(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)檢(jian)查了相同的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)可(ke)(ke)電(dian)離脂(zhi)(zhi)(zhi)質庫(ku)，同樣發(fa)(fa)現可(ke)(ke)降(jiang)(jiang)解(jie)，并且由于伯酯(zhi)(zhi)而迅速消除(chu)，并且對(dui)于流感核苷修飾的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)mRNA%__，與(yu)(yu)MC3相比(bi)，在(zai)蛋白表(biao)達或免(mian)疫(yi)原性(xing)(xing)方面效(xiao)(xiao)(xiao)價通常增(zeng)(zeng)加(jia)(jia)(jia)3-6倍(bei)。小(xiao)鼠(shu)中(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)%編碼的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)免(mian)疫(yi)原，盡(jin)管非人(ren)靈長(chang)(chang)類(lei)動物中(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)免(mian)疫(yi)原性(xing)(xing)與(yu)(yu)5µg初免(mian)-加(jia)(jia)(jia)強免(mian)疫(yi)劑量下的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)MC3相同[42]。脂(zhi)(zhi)(zhi)質H或SM-102（表(biao)2）被確定(ding)為(wei)(wei)最佳(jia)候選藥(yao)物，在(zai)結構(gou)上(shang)僅與(yu)(yu)通過伯酯(zhi)(zhi)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)二碳置換確定(ding)為(wei)(wei)IV給(gei)藥(yao)最佳(jia)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)脂(zhi)(zhi)(zhi)質5不同。脂(zhi)(zhi)(zhi)質5 LNP的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)pKa為(wei)(wei)6.56，而脂(zhi)(zhi)(zhi)質H LNP的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)pKa為(wei)(wei)6.68，表(biao)明IM與(yu)(yu)IV給(gei)藥(yao)相比(bi)，pKa略微增(zeng)(zeng)加(jia)(jia)(jia)可(ke)(ke)能(neng)有(you)(you)益，盡(jin)管該(gai)差異在(zai)試驗(yan)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)變異性(xing)(xing)范圍(wei)內(nei)。大(da)鼠(shu)肌肉注(zhu)射(she)部位(wei)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)組織學(xue)檢(jian)查表(biao)明，與(yu)(yu)MC3相比(bi)，Lipid HLNPs吸引的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)中(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)性(xing)(xing)粒細胞(bao)和(he)巨(ju)噬細胞(bao)富集的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)炎性(xing)(xing)浸潤較(jiao)少(shao)，這(zhe)可(ke)(ke)能(neng)會降(jiang)(jiang)低人(ren)體(ti)(ti)試驗(yan)中(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)注(zhu)射(she)部位(wei)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)反應原性(xing)(xing)[42]。

目前SARS-CoV-2臨床試驗中的mRNA脂(zhi)質納米顆粒

5.1.BioNTech/Pfizer

Acuitas ALC-0315（表2）結(jie)合(he)DSPC、膽固醇和(he)PEG脂質是BioNTech SARS-COV-2試驗中的遞送系統[40]。CureVac和(he)倫敦帝(di)國理工學(xue)院也可(ke)能(neng)使用ALC-0315，或可(ke)能(neng)使用A9（表2）。

BioNTech開(kai)始(shi)用(yong)4種mRNA編碼(ma)的(de)(de)(de)(de)免(mian)疫(yi)原開(kai)發其(qi)SARS-CoV-2疫(yi)苗，其(qi)中2種是(shi)核苷修飾的(de)(de)(de)(de)，1種是(shi)未(wei)修飾的(de)(de)(de)(de)，1種是(shi)自我擴增的(de)(de)(de)(de)。有兩種核苷修飾的(de)(de)(de)(de)mRNA的(de)(de)(de)(de)報道：BNT162b1是(shi)編碼(ma)刺突(tu)蛋白受體(ti)結合(he)(he)域(yu)的(de)(de)(de)(de)短(duan)的(de)(de)(de)(de)~1kb序列，通過foldon三聚體(ti)結構域(yu)修飾，通過多價顯示增加免(mian)疫(yi)原性(xing)。較長(chang)的(de)(de)(de)(de)4.3kb BNT162b2編碼(ma)一個(ge)二脯氨酸(suan)穩定的(de)(de)(de)(de)全長(chang)膜結合(he)(he)刺突(tu)蛋白。BNT162b2最(zui)近獲得(de)了歐盟和美國的(de)(de)(de)(de)緊急批準。

在(zai)一項(xiang)臨床前(qian)研(yan)究中(zhong)(zhong)(zhong)，小(xiao)鼠單次給予0.2、1和(he)5µg BNT162b2后，可檢(jian)測(ce)到結合抗體和(he)中(zhong)(zhong)(zhong)和(he)滴度(du)。從(cong)最低劑量(liang)(liang)到最高劑量(liang)(liang)增(zeng)加一個數量(liang)(liang)級，在(zai)Th2細(xi)胞(bao)(bao)因子(zi)水平非常(chang)低的(de)CD4 + 和(he)CD8 + 脾(pi)細(xi)胞(bao)(bao)中(zhong)(zhong)(zhong)引起強烈的(de)抗原特異性(xing)Th1 IFNγ和(he)IL-2應答[49]。引流淋(lin)巴結中(zhong)(zhong)(zhong)還含(han)有大量(liang)(liang)生(sheng)發中(zhong)(zhong)(zhong)心(xin)B細(xi)胞(bao)(bao)以(yi)及(ji)CD4 + 和(he)CD8 + 濾泡輔(fu)助性(xing)T(Tfh)細(xi)胞(bao)(bao)計數升高，這(zhe)些細(xi)胞(bao)(bao)先前(qian)被(bei)確定為(wei)mRNA LNP疫(yi)苗中(zhong)(zhong)(zhong)LNP單獨誘導(dao)的(de)一部(bu)分(fen)[33]。在(zai)非人靈長類(lei)動(dong)物中(zhong)(zhong)(zhong)，30µg或100µg的(de)初(chu)免(mian)-加強免(mian)疫(yi)劑量(liang)(liang)引起的(de)結合抗體和(he)中(zhong)(zhong)(zhong)和(he)滴度(du)是人恢復(fu)期試驗組的(de)10倍以(yi)上，并且產(chan)生(sheng)強烈的(de)Th1偏(pian)倚(yi)T細(xi)胞(bao)(bao)應答，該(gai)應答被(bei)認為(wei)對預防疫(yi)苗相關(guan)的(de)增(zeng)強呼吸道疾病很重要[107]。在(zai)有限(xian)數量(liang)(liang)(6)的(de)攻毒恒河猴中(zhong)(zhong)(zhong)，兩次100µg劑量(liang)(liang)在(zai)支氣管肺泡灌洗(xi)和(he)鼻(bi)拭子(zi)中(zhong)(zhong)(zhong)檢(jian)測(ce)不(bu)到病毒滴度(du)。

較小mRNA編碼免疫原BNT162b1的(de)(de)1期臨(lin)床試(shi)驗計劃(hua)在第(di)1天和(he)(he)(he)第(di)21天給予10、30和(he)(he)(he)100µg劑(ji)量(liang)。中(zhong)等劑(ji)量(liang)30µg誘(you)導的(de)(de)抗體結合和(he)(he)(he)中(zhong)和(he)(he)(he)滴度(du)分別是人恢復期組(zu)的(de)(de)30倍和(he)(he)(he)3倍。由于首次(ci)給藥后存在重度(du)注射部位疼痛，因此(ci)未給予100µg劑(ji)量(liang)進行加(jia)強劑(ji)量(liang)。30µg加(jia)強劑(ji)量(liang)組(zu)100%的(de)(de)受試(shi)者(zhe)報告了注射部位疼痛，但嚴重程度(du)為輕(qing)度(du)或中(zhong)度(du)。以30µg劑(ji)量(liang)第(di)二次(ci)接種(zhong)疫苗(miao)后，幾乎(hu)所(suo)有(you)受試(shi)者(zhe)均發生輕(qing)度(du)或中(zhong)度(du)全身不良事件發熱(re)、寒戰或疲(pi)乏(fa)。該試(shi)驗還證明了外(wai)周(zhou)血(xue)單核細胞對(dui)Th1偏倚T細胞的(de)(de)強烈應答(da)[50]。

一項2期試(shi)驗在(zai)年(nian)(nian)輕（18-55歲）和年(nian)(nian)長（65-85歲）受(shou)(shou)(shou)試(shi)者(zhe)組(zu)中(zhong)(zhong)比較了(le)BNT162b1和BNT162b2[51]。老年(nian)(nian)受(shou)(shou)(shou)試(shi)者(zhe)的(de)(de)(de)結合和中(zhong)(zhong)和抗體(ti)滴(di)度略低(di)，但仍超過恢(hui)復(fu)期組(zu)。與年(nian)(nian)輕受(shou)(shou)(shou)試(shi)者(zhe)相(xiang)比，老年(nian)(nian)受(shou)(shou)(shou)試(shi)者(zhe)的(de)(de)(de)不(bu)良反(fan)應嚴重程度也降低(di)。與BNT162b1相(xiang)比，在(zai)BNT162b2中(zhong)(zhong)發(fa)現全身不(bu)良事件（發(fa)熱(re)、寒戰(zhan)、疲乏(fa)）的(de)(de)(de)頻率(lv)顯著降低(di)約(yue)兩(liang)倍(bei)。正是BNT162b2耐受(shou)(shou)(shou)性(xing)的(de)(de)(de)增加推(tui)動了(le)其選擇進入3期試(shi)驗，最近宣(xuan)布了(le)94%的(de)(de)(de)有效性(xing)，因為在(zai)安慰劑組(zu)中(zhong)(zhong)發(fa)生(sheng)了(le)162例COVID-19病(bing)例，而在(zai)接受(shou)(shou)(shou)兩(liang)次30µg BNT162b2給藥(yao)的(de)(de)(de)疫苗接種組(zu)中(zhong)(zhong)僅發(fa)現了(le)8例病(bing)例[3]

5.2. Moderna

在(zai)Moderna的(de)(de)(de)(de)研究中(zhong)(zhong)，核苷修飾(shi)的(de)(de)(de)(de)mRNA編碼(ma)免疫原(yuan)是一種(zhong)(zhong)跨膜錨定的(de)(de)(de)(de)二脯氨酸穩定的(de)(de)(de)(de)融合前(qian)刺突，具有(you)天然(ran)的(de)(de)(de)(de)furin裂解位點，并在(zai)原(yuan)型MC3 LNP基礎上的(de)(de)(de)(de)LNP中(zhong)(zhong)遞送，只是用Lipid H(SM-102)替代MC3[41,42]。該(gai)mRNA LNP(mRNA-1273)在(zai)第(di)1天和(he)第(di)21天以1µg劑(ji)(ji)量(liang)(liang)注射時(shi)在(zai)幾種(zhong)(zhong)小(xiao)鼠種(zhong)(zhong)屬(shu)中(zhong)(zhong)誘導中(zhong)(zhong)和(he)抗體(ti)(ti)，但在(zai)0.1µg劑(ji)(ji)量(liang)(liang)時(shi)未(wei)誘導中(zhong)(zhong)和(he)抗體(ti)(ti)[44]。T細(xi)胞應(ying)(ying)(ying)答似乎(hu)是平衡的(de)(de)(de)(de)Th1/Th2應(ying)(ying)(ying)答，在(zai)小(xiao)鼠適應(ying)(ying)(ying)的(de)(de)(de)(de)病毒(du)攻(gong)毒(du)模型中(zhong)(zhong)，小(xiao)鼠肺(fei)和(he)鼻(bi)甲中(zhong)(zhong)的(de)(de)(de)(de)病毒(du)滴度在(zai)2次劑(ji)(ji)量(liang)(liang)1µg給(gei)藥后降(jiang)低(di)至(zhi)(zhi)基線，但在(zai)0.1µg給(gei)藥后未(wei)降(jiang)低(di)。在(zai)恒(heng)河猴中(zhong)(zhong)，2劑(ji)(ji)100µg劑(ji)(ji)量(liang)(liang)在(zai)外周血中(zhong)(zhong)產生高結合和(he)中(zhong)(zhong)和(he)滴度以及Th1偏倚反應(ying)(ying)(ying)，也涉及強(qiang)烈的(de)(de)(de)(de)Tfh反應(ying)(ying)(ying)[45]。兩個10µg劑(ji)(ji)量(liang)(liang)組的(de)(de)(de)(de)滴度和(he)T細(xi)胞應(ying)(ying)(ying)答顯著降(jiang)低(di)。同樣，100µg劑(ji)(ji)量(liang)(liang)能夠(gou)將支氣(qi)管肺(fei)泡灌洗(xi)液和(he)鼻(bi)拭子(zi)中(zhong)(zhong)的(de)(de)(de)(de)病毒(du)滴度降(jiang)低(di)至(zhi)(zhi)基線，而10µg僅在(zai)肺(fei)部降(jiang)低(di)。

在(zai)1期(qi)研(yan)究(jiu)中(zhong)(zhong)，每組15例患(huan)者(zhe)接受2劑(ji)25、100或250µg，間(jian)隔4周，結合和(he)(he)(he)(he)中(zhong)(zhong)和(he)(he)(he)(he)滴度比100µg劑(ji)量(liang)的(de)恢復(fu)期(qi)高約(yue)(yue)10倍(bei)，約(yue)(yue)相(xiang)當于(yu)(yu)25µg的(de)恢復(fu)期(qi)[46]。100µg和(he)(he)(he)(he)250µg劑(ji)量(liang)組所有(you)(you)受試(shi)(shi)者(zhe)均(jun)報(bao)告征集性(xing)不(bu)(bu)良事(shi)(shi)件(jian)，250µg組14例受試(shi)(shi)者(zhe)中(zhong)(zhong)的(de)3例報(bao)告重度不(bu)(bu)良事(shi)(shi)件(jian)并停藥(yao)。在(zai)隨后的(de)老年患(huan)者(zhe)（56-71歲和(he)(he)(he)(he)71歲以上）1期(qi)研(yan)究(jiu)中(zhong)(zhong)，發現(xian)25µg和(he)(he)(he)(he)100µg劑(ji)量(liang)產生的(de)結合抗體(ti)滴度高于(yu)(yu)恢復(fu)期(qi)血(xue)漿，而100µg劑(ji)量(liang)的(de)中(zhong)(zhong)和(he)(he)(he)(he)滴度相(xiang)當，但低于(yu)(yu)25µg劑(ji)量(liang)的(de)恢復(fu)期(qi)[43]。大多數(shu)患(huan)者(zhe)（約(yue)(yue)80%）在(zai)第二次(ci)接種疫苗(miao)(miao)后仍發生不(bu)(bu)良事(shi)(shi)件(jian)，即使是在(zai)老年組。外周血(xue)分(fen)析(xi)顯(xian)示(shi)CD4 T細胞(bao)應答存在(zai)Th1偏倚。與(yu)25µg劑(ji)量(liang)相(xiang)比，100µg劑(ji)量(liang)的(de)中(zhong)(zhong)和(he)(he)(he)(he)滴度更高，因此選擇(ze)該劑(ji)量(liang)用于(yu)(yu)3期(qi)試(shi)(shi)驗，中(zhong)(zhong)期(qi)結果顯(xian)示(shi)90例COVID-19病例在(zai)安慰(wei)劑(ji)組與(yu)5例在(zai)疫苗(miao)(miao)接種組具有(you)(you)94.5%的(de)有(you)(you)效性(xing)[2]。一個(ge)獨立的(de)委員會(hui)對(dui)Moderna的(de)3期(qi)試(shi)(shi)驗進行了中(zhong)(zhong)期(qi)分(fen)析(xi)，發現(xian)嚴重不(bu)(bu)良事(shi)(shi)件(jian)包括9.7%的(de)參與(yu)者(zhe)出現(xian)疲勞，8.9%出現(xian)肌肉疼痛(tong)(tong)，5.2%出現(xian)關節痛(tong)(tong)，4.5%出現(xian)頭痛(tong)(tong)，而在(zai)輝瑞(rui)/BioNTech的(de)3期(qi)試(shi)(shi)驗中(zhong)(zhong)，頻率較(jiao)低的(de)是疲勞為3.8%，頭痛(tong)(tong)為2%[108]。

5.3. CureVac

The CureVac mRNA LNP(CVnCoV)是一種非(fei)化學修(xiu)飾的(de)(de)(de)(de)序列工程mRNA，編(bian)碼在Acuitas LNP中(zhong)遞送的(de)(de)(de)(de)二脯氨酸穩(wen)定的(de)(de)(de)(de)全(quan)長S蛋白(bai)，可能使(shi)用可電離脂質(zhi)ALC-0315。在小鼠(shu)中(zhong)使(shi)用2µg劑(ji)量時，檢(jian)查了(le)兩(liang)次(ci)給藥之間(jian)的(de)(de)(de)(de)周數，范圍為1-4周，發現Balb/c小鼠(shu)中(zhong)較長的(de)(de)(de)(de)間(jian)隔(ge)產(chan)生了(le)較高的(de)(de)(de)(de)滴度(du)和(he)T細胞應答以(yi)及平衡(heng)的(de)(de)(de)(de)Th1/Th2應答[53]。需要第二次(ci)給藥以(yi)產(chan)生中(zhong)和(he)抗(kang)體，0.25µg的(de)(de)(de)(de)兩(liang)次(ci)給藥不足以(yi)產(chan)生中(zhong)和(he)抗(kang)體。在敘利亞金(jin)黃地鼠(shu)中(zhong)，兩(liang)次(ci)10µg劑(ji)量（而非(fei)2µg）能夠將肺(fei)（而非(fei)鼻甲）中(zhong)的(de)(de)(de)(de)病毒(du)滴度(du)降低至基線(xian)。

在(zai)檢查2-12µg劑量(liang)(liang)的1期臨床試(shi)驗中，僅在(zai)最高(gao)12µg劑量(liang)(liang)下(xia)發現達到恢復期血清水(shui)平(ping)的中和滴度(du)(du)，導致(zhi)正(zheng)在(zai)進行的2期試(shi)驗納入更高(gao)劑量(liang)(liang)16和20µg[52]。接受12µg劑量(liang)(liang)的所有患(huan)者(zhe)在(zai)每(mei)次(ci)給藥后均發生(sheng)全身不良事(shi)件(jian)，大多數為中度(du)(du)和重(zhong)度(du)(du)，而 > 80%的患(huan)者(zhe)在(zai)輕度(du)(du)和中度(du)(du)水(shui)平(ping)發生(sheng)局部注射部位疼痛。

5.4. TranslateBio

Translate Bio使用(yong)非(fei)修(xiu)飾的(de)mRNA編(bian)碼雙突(tu)變形(xing)式的(de)二脯氨酸(suan)(suan)穩(wen)定的(de)刺突(tu)蛋白，并通過(guo)被引用(yong)為基于可(ke)電離(li)脂質C12-200[109]的(de)LNP進行遞(di)送，其可(ke)能是最近從ICE-[110]或(huo)基于半胱(guang)氨酸(suan)(suan)的(de)[55]可(ke)電離(li)脂質家族合成的(de)候選物(wu)。在Balb/c小鼠中(zhong)，0.2–10µg范圍(wei)內的(de)兩次給(gei)藥導致結合和(he)中(zhong)和(he)滴度遠高(gao)于恢復期水(shui)平。在非(fei)人(ren)靈長類(lei)動(dong)物(wu)中(zhong)，15、45和(he)135µg劑量產生的(de)滴度均超過(guo)人(ren)恢復期組[56]。免疫應(ying)答(da)也存(cun)在Th1偏(pian)倚(yi)。

5.5. Arcturus

Arcturus使用自擴增、全長、未修飾的(de)mRNA編碼融合前SARS-CoV-2全長刺(ci)突蛋白，通(tong)(tong)過LNP進行(xing)遞送，該LNP使用可電(dian)離脂(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)與硫酯，通(tong)(tong)過兩(liang)個(ge)額外的(de)酯基(ji)(ji)將(jiang)含胺的(de)頭基(ji)(ji)與脂(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)尾部連接(jie)。該家族中兩(liang)種可能的(de)可電(dian)離脂(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)是脂(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)10a（[111]的(de)表4）或(huo)脂(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)2,2(8,8)4 C CH3（[57]的(de)第33頁）（表2）。后(hou)者有三(san)個(ge)分支，類似(si)于Moderna Lipid H，但有一個(ge)可降解的(de)硫酯與頭基(ji)(ji)連接(jie)。觀察到自身擴增mRNA的(de)特征，即IM給藥后(hou)1周以上(shang)，熒光素酶報告基(ji)(ji)因表達維持在(zai)相當恒(heng)定的(de)水平，而常規mRNA表達迅速下降[58]。

單獨接種疫苗在(zai)(zai)C57BL/6小(xiao)(xiao)鼠(shu)中(zhong)產生了令人驚(jing)訝(ya)地體重(zhong)減(jian)輕和(he)(he)臨(lin)床(chuang)評分增加。小(xiao)(xiao)鼠(shu)中(zhong)僅需(xu)要(yao)2µg或10µg（而非0.2µg）單次給(gei)藥，即(ji)可(ke)在(zai)(zai)Th1偏倚(yi)應(ying)答(da)(da)中(zhong)達到(dao)高(gao)于100的(de)中(zhong)和(he)(he)滴(di)度，并(bing)具有高(gao)水平(ping)的(de)抗(kang)原特異性T細胞應(ying)答(da)(da)。在(zai)(zai)K18-hACE2致死小(xiao)(xiao)鼠(shu)激發(fa)模型中(zhong)，2µg或10µg單次給(gei)藥也具有100%保護作(zuo)用，100%存活，無體重(zhong)減(jian)輕，肺和(he)(he)腦(nao)病(bing)毒滴(di)度降低至基線水平(ping)。Arcturus已經完(wan)成了1期(qi)臨(lin)床(chuang)試驗，劑(ji)量為1-10µg，并(bing)選擇7.5µg進行3期(qi)試驗[112]。

5.6.帝國理工學(xue)院

倫敦(dun)帝國(guo)理工學院使用Acuitas LNP遞送的(de)自擴增mRNA編碼的(de)融(rong)合前穩定的(de)刺突蛋(dan)白，該(gai)LNP在(zai)Lipid A9[60]代表(biao)的(de)專(zhuan)利(li)[59]中(zhong)進行了描述（表(biao)2）。在(zai)Balb/c小(xiao)鼠兩次注射0.01µg至(zhi)10µg劑量(liang)(liang)范圍后，獲得了較高的(de)劑量(liang)(liang)依賴性(xing)抗體和(he)中(zhong)和(he)滴度。該(gai)應答存在(zai)強烈的(de)Th1偏倚，與較低的(de)0.1和(he)0.01µg劑量(liang)(liang)相(xiang)比(bi)，10和(he)1µg劑量(liang)(liang)產生的(de)抗原(yuan)特異性(xing)脾細胞(bao)應答高3倍。這種疫苗的(de)1期臨床試驗即(ji)將開始。

5.7.朱(zhu)拉隆功大學(xue)、賓夕法尼亞大學(xue)

朱拉隆功大(da)學(xue)與賓夕法尼(ni)亞(ya)大(da)學(xue)合作，正(zheng)在使用Genevant LNP（可能是CL1脂質(zhi)）開(kai)發一種天然的加標免疫(yi)原核苷修飾的mRNA LNP[61]。他們的目標是在2021年(nian)第1季度開(kai)始1期臨床試驗(yan)，并在2021年(nian)第4季度開(kai)始將疫(yi)苗分發給(gei)泰(tai)國和7個周(zhou)圍(wei)的低至中(zhong)等收入(ru)國家。

5.8. Providence Therapeutics

Providence Therapeutics被授予加拿大衛生(sheng)部許(xu)可進行PTX-COVID-19B mRNA LNP疫(yi)苗人體臨床試(shi)驗(yan)的(de)(de)(de)通知[113]。C57BL6小鼠(shu)按照初免(mian)-加強免(mian)疫(yi)方案接受(shou)20µg劑量給藥后(hou)，對編(bian)碼受(shou)體結合域（furin裂解位點有或無(wu)突(tu)變的(de)(de)(de)全(quan)長加標物）的(de)(de)(de)三(san)種mRNA候(hou)選物進行臨床前(qian)(qian)研究(jiu)[114]。來自Genevant未披(pi)露脂質(zhi)的(de)(de)(de)臨床前(qian)(qian)數據結果（可能與(yu)(yu)表2中(zhong)的(de)(de)(de)CL1相(xiang)似(si)(si)）顯示出對于(yu)全(quan)長和furin突(tu)變有效(xiao)負(fu)載的(de)(de)(de)穩健中(zhong)和滴度(du)，與(yu)(yu)[115]中(zhong)觀察到(dao)的(de)(de)(de)數據相(xiang)似(si)(si)。1期臨床試(shi)驗(yan)計劃于(yu)2021年(nian)第一季度(du)開始(shi)，疫(yi)苗的(de)(de)(de)生(sheng)產和分(fen)銷——等待監管批準——在(zai)同年(nian)進行。

5.9.儲存和分銷

大(da)多數在(zai)實驗室中(zhong)制(zhi)造的RNA LNPs在(zai)4 °C下可穩(wen)(wen)定數天(tian)，但(dan)隨(sui)(sui)后(hou)表(biao)現出體積增(zeng)大(da)和生(sheng)物活性(xing)逐(zhu)漸喪失，如熒(ying)光素酶表(biao)達(da)[116]。在(zai)之(zhi)(zhi)(zhi)前的siRNA LNP制(zhi)劑中(zhong)，通常(chang)觀(guan)察到LNP聚集的大(da)小(xiao)隨(sui)(sui)時間(jian)增(zeng)加[117]。為了穩(wen)(wen)定用于儲存和分銷(xiao)的mRNA LNP疫(yi)苗，迄(qi)今為止需要冷(leng)凍(dong)(dong)形(xing)式。Moderna COVID-19疫(yi)苗需要在(zai)-25 ℃～-15 ℃保存，但(dan)在(zai)2 ℃～8 ℃之(zhi)(zhi)(zhi)間(jian)也(ye)可穩(wen)(wen)定長達(da)30天(tian)，在(zai)8 ℃～25 ℃之(zhi)(zhi)(zhi)間(jian)可穩(wen)(wen)定長達(da)12 h[118]。輝(hui)瑞/BioNTech COVID-19疫(yi)苗需要在(zai)-80 ℃至-60 ℃下儲存，然后(hou)解(jie)凍(dong)(dong)并在(zai)2 ℃至8 ℃下儲存長達(da)5天(tian)，然后(hou)在(zai)注射(she)前用生(sheng)理鹽(yan)水稀釋[119]。

與(yu)Moderna疫苗所(suo)需的常規冷凍溫(wen)(wen)度(du)相比，輝瑞(rui)疫苗在分(fen)銷(xiao)和儲存期間所(suo)需的干冰溫(wen)(wen)度(du)更難達(da)到。這些溫(wen)(wen)差背(bei)后的原(yuan)因(yin)并(bing)不明顯，因(yin)為兩種(zhong)(zhong)疫苗均(jun)含(han)有相似的高濃度(du)蔗(zhe)糖(tang)作(zuo)為冷凍保護劑。Moderna mRNA LNPs在Tris和醋酸(suan)鹽兩種(zhong)(zhong)緩沖液中冷凍[41]，而Pfizer/BioNTech疫苗僅使用磷(lin)(lin)酸(suan)鹽緩沖液[40]。已知磷(lin)(lin)酸(suan)鹽緩沖液對(dui)冷凍不理想(xiang)，因(yin)為其易于沉淀，并(bing)在冰結晶開始時(shi)引起pH值突然(ran)變(bian)化(hua)[120,121]。凍干對(dui)于mRNA LNPs一(yi)直具有挑戰性[116]。然(ran)而，Arcturus表示，他們的COVID-19 mRNA疫苗在凍干形式下是(shi)穩定的，這大(da)概會大(da)大(da)簡化(hua)分(fen)布，盡管這種(zhong)(zhong)凍干制(zhi)劑的溫(wen)(wen)度(du)穩定性尚未(wei)披(pi)露[122]。

原文來源：Automated Manufacture of Autologous CD19 CAR-T Cells for Treatment of Non-hodgkin Lymphoma.Front.Immunol.11:1941. DOI:10.3389/fimmu.2020.01941