Life Med|脂質納米顆粒靶向遞送mRNA研發策(ce)略

湃客：Life Medicine 2022-06-28 07:06

針對近幾年席卷全球的新型冠狀病毒（COVID-19），疫苗研發一直是布局重點和焦點，被寄予厚望。其中，BNT162b（商品名Comirnaty）和mRNA-1273（商品名Spikevax）兩款mRNA納米疫苗以其極高的保護效率和研發速度聞名于世，并迅速引發國內外廣泛關注。目前，以mRNA疫苗為研究熱點的核酸疫苗被視為是繼（減毒）滅活疫苗、亞單位疫苗之后的第三代新型疫苗，正在引領疫苗研發的潮流，相關產業也正如火如荼的進行中。“新冠”mRNA疫苗的成功同時推動了全球范圍內mRNA的產業化進程。 這些事件的背后實際上是mRNA分子優化、體內遞送等底層相關技術取得的長足進展，特別是在脂質納米顆粒（LNPs）遞送平臺的突破。一般認為，LNPs是遞送mRNA最好的選擇之一，若要擴寬mRNA的應用場景，研發靶向遞送LNPs技術至關重要。

底層技術的發展加速mRNA應用

自20世紀(ji)60年代mRNA被發現以(yi)來(lai)，有關mRNA的(de)應用探(tan)索就一刻也不曾停止。mRNA分(fen)子具有不穩定性(xing)、免(mian)疫原性(xing)、無(wu)法高效進入細胞等特點(dian)，在實際應用中非常受限。隨著mRNA分(fen)子優化技術、遞送技術平(ping)臺的(de)不斷(duan)發展，這(zhe)些缺(que)點(dian)正在慢慢地被克服。

其(qi)一，mRNA分(fen)子優(you)化(hua)(hua)平(ping)(ping)臺(tai)，包(bao)括有(you)：1）序(xu)列(lie)優(you)化(hua)(hua)的(de)(de)(de)(de)進(jin)展(zhan)，如(ru)5，3端非翻譯區(qu)序(xu)列(lie)的(de)(de)(de)(de)篩選(xuan)、多(duo)聚腺嘌(piao)呤（poly A）尾(wei)巴的(de)(de)(de)(de)長度優(you)化(hua)(hua)、開放(fang)閱讀框（ORF）密碼子的(de)(de)(de)(de)優(you)選(xuan)等(deng)；2）核(he)苷(gan)酸化(hua)(hua)學修飾的(de)(de)(de)(de)引入，如(ru)5-甲基(ji)尿(niao)苷(gan)和N1-甲基(ji)假尿(niao)苷(gan)的(de)(de)(de)(de)使用(yong)不僅能(neng)(neng)降低mRNA的(de)(de)(de)(de)免(mian)疫原性(xing)，還能(neng)(neng)提(ti)高其(qi)穩(wen)定性(xing)；3）制(zhi)備(bei)工(gong)藝的(de)(de)(de)(de)提(ti)升(sheng)，如(ru)體外轉錄（IVT）放(fang)大工(gong)藝的(de)(de)(de)(de)成(cheng)熟、加帽工(gong)序(xu)的(de)(de)(de)(de)簡(jian)化(hua)(hua)、純(chun)化(hua)(hua)和質檢方(fang)法的(de)(de)(de)(de)穩(wen)定等(deng)。其(qi)二，遞送載體平(ping)(ping)臺(tai)，尤(you)其(qi)是(shi)LNPs遞送技術的(de)(de)(de)(de)相對(dui)成(cheng)熟。一般來(lai)講，LNPs由四(si)種(zhong)(zhong)成(cheng)分(fen)組成(cheng)，每種(zhong)(zhong)成(cheng)分(fen)都扮(ban)演著相對(dui)重(zhong)要的(de)(de)(de)(de)角色：可電離陽離子脂(zhi)(zhi)(zhi)質被認為是(shi)LNPs中最重(zhong)要的(de)(de)(de)(de)成(cheng)分(fen)，它直接決定了(le)mRNA的(de)(de)(de)(de)包(bao)裹效率和遞送效率；中性(xing)輔助(zhu)磷脂(zhi)(zhi)(zhi)（如(ru)DSPC、DOPE）和膽固(gu)醇(chun)脂(zhi)(zhi)(zhi)質有(you)助(zhu)于(yu)提(ti)升(sheng)LNPs的(de)(de)(de)(de)穩(wen)定性(xing)以及(ji)轉染效率；聚乙二醇(chun)脂(zhi)(zhi)(zhi)（PEG-Lipid）在(zai)調節LNPs尺寸(cun)、穩(wen)定性(xing)、半衰期、遞送效率等(deng)方(fang)面的(de)(de)(de)(de)作用(yong)也十(shi)分(fen)明顯。值得指出的(de)(de)(de)(de)是(shi)，LNPs中單一成(cheng)分(fen)并非獨自行使功能(neng)(neng)，各組分(fen)之(zhi)間的(de)(de)(de)(de)配比在(zai)mRNA的(de)(de)(de)(de)實際應用(yong)中非常重(zhong)要。

通過多手段(duan)研發(fa)技術，目前LNPs-mRNA已(yi)被(bei)應(ying)用到多個領(ling)域(yu)，包括疫苗研發(fa)、針(zhen)對多種重(zhong)大疾(ji)病(bing)的(de)蛋白替(ti)代療法、基(ji)因編輯療法、細胞療法等(deng)方面(mian)。 

LNPs靶向(xiang)遞送策(ce)略擴寬mRNA應用(yong)場景

mRNA精(jing)準遞(di)送(song)(song)是保(bao)證治療效果的(de)必要條件之一。針(zhen)對(dui)體表的(de)組織器官（如肌肉(rou)、眼(yan)等）可通過局部給(gei)藥(yao)方式實(shi)現，而體內更(geng)深層次器官的(de)遞(di)送(song)(song)則選擇(ze)靜脈注射更(geng)為合適。靜脈給(gei)藥(yao)后LNPs介導的(de)肝臟靶(ba)向(xiang)較容易實(shi)現，如何(he)實(shi)現肝外的(de)選擇(ze)性遞(di)送(song)(song)則具有挑戰。針(zhen)對(dui)此科學問題，研究人員嘗(chang)試了(le)多種策(ce)略(lve)，取得了(le)不錯進展。本亮點(dian)文(wen)章重點(dian)總結了(le)近期發(fa)表的(de)幾(ji)類mRNA靶(ba)向(xiang)遞(di)送(song)(song)策(ce)略(lve)。

（一）靶向(xiang)分子修(xiu)飾

在(zai)LNPs表(biao)(biao)面(mian)進行靶(ba)向分(fen)子修(xiu)飾(shi)(shi)是實現(xian)(xian)細胞(bao)(bao)靶(ba)向遞送(song)最直接(jie)的(de)(de)(de)方法。Jonathan A. Epstein教授團隊最近利用(yong)CD5抗體修(xiu)飾(shi)(shi)包裹了(le)CAR mRNA的(de)(de)(de)LNPs，可(ke)提(ti)高其體內靶(ba)向T淋巴細胞(bao)(bao)的(de)(de)(de)能力(li)(li)。將(jiang)上(shang)述mRNA制劑靜脈注射到心(xin)衰(shuai)小(xiao)(xiao)鼠模型(xing)后，可(ke)在(zai)體內對(dui)T細胞(bao)(bao)進行重編程，使其形成有(you)功能的(de)(de)(de)CAR-T細胞(bao)(bao)，可(ke)以靶(ba)向過度活躍(yue)的(de)(de)(de)心(xin)臟(zang)成纖(xian)維(wei)細胞(bao)(bao)，有(you)效降低了(le)心(xin)臟(zang)纖(xian)維(wei)化，并幫助小(xiao)(xiao)鼠恢(hui)復(fu)了(le)心(xin)臟(zang)功能。Dan Peer教授團隊通(tong)過重組(zu)融合蛋白(bai)（MadCAM-1-D1D2-Fc）修(xiu)飾(shi)(shi)LNPs技術，將(jiang)mRNA選擇性遞送(song)到特定白(bai)細胞(bao)(bao)亞群(qun)，在(zai)結(jie)腸炎小(xiao)(xiao)鼠模型(xing)中展現(xian)(xian)出(chu)了(le)潛在(zai)的(de)(de)(de)治(zhi)療前景。不同(tong)于(yu)抗體修(xiu)飾(shi)(shi)，Gabriel A. Kwong課(ke)題(ti)組(zu)最近開發了(le)一(yi)種光(guang)控的(de)(de)(de)多(duo)(duo)肽配體置換(huan)平臺，可(ke)快(kuai)速(su)變換(huan)修(xiu)飾(shi)(shi)到LNPs表(biao)(biao)面(mian)的(de)(de)(de)靶(ba)向抗原多(duo)(duo)肽，在(zai)體內實現(xian)(xian)對(dui)多(duo)(duo)種抗原特異性T細胞(bao)(bao)群(qun)的(de)(de)(de)靶(ba)向mRNA遞送(song)。以上(shang)修(xiu)飾(shi)(shi)技術可(ke)顯著(zhu)增(zeng)強(qiang)對(dui)特定細胞(bao)(bao)類型(xing)的(de)(de)(de)靶(ba)向遞送(song)能力(li)(li)，但在(zai)特異性方面(mian)略顯不足。

（二(er)）高通量(liang)篩選

上文提(ti)到(dao)，可離(li)子化陽(yang)離(li)子脂質是(shi)(shi)LNPs中最重要的(de)(de)(de)(de)成分。通(tong)(tong)過結構(gou)各(ge)異的(de)(de)(de)(de)化學(xue)結構(gou)庫進行(xing)高(gao)通(tong)(tong)量篩(shai)選(xuan)早已被證實是(shi)(shi)研(yan)(yan)發(fa)靶(ba)向LNPs最為(wei)有效的(de)(de)(de)(de)方(fang)(fang)法之一(yi)，目前大(da)多數LNPs是(shi)(shi)由此技術研(yan)(yan)發(fa)產生的(de)(de)(de)(de)，可實現肝、肺、脾、腦(nao)等器官的(de)(de)(de)(de)mRNA遞送,但此方(fang)(fang)法相對盲目、工(gong)作量大(da)。James Dahlman課題組結合“DNA條形碼”和深(shen)度測序技術，開發(fa)了一(yi)種新型的(de)(de)(de)(de)高(gao)通(tong)(tong)量篩(shai)選(xuan)技術，簡稱為(wei)FIND，可顯著提(ti)升(sheng)LNPs的(de)(de)(de)(de)篩(shai)選(xuan)效率。他們將Cre mRNA和特(te)定序列(lie)的(de)(de)(de)(de)DNA條形碼包裹到(dao)同一(yi)個(ge)LNPs中，只需設計不同的(de)(de)(de)(de)DNA條形碼就(jiu)可制備出(chu)帶有特(te)定“標簽”的(de)(de)(de)(de)一(yi)系列(lie)LNPs-mRNA藥物(wu)。將這些“標簽”各(ge)異的(de)(de)(de)(de)LNPs通(tong)(tong)過靜脈一(yi)起注射到(dao)Cre誘導表達(da)tdTom的(de)(de)(de)(de)轉基因小鼠(shu)中，利(li)用流(liu)式細(xi)胞儀檢測tdTom陽(yang)性(xing)細(xi)胞，并結合DNA深(shen)度測序的(de)(de)(de)(de)方(fang)(fang)法可鑒別出(chu)特(te)定細(xi)胞靶(ba)向的(de)(de)(de)(de)LNPs載體。通(tong)(tong)過該體系，他們可同步(bu)篩(shai)選(xuan)超(chao)200種LNPs，顯著提(ti)高(gao)了LNPs的(de)(de)(de)(de)篩(shai)選(xuan)效率。

（三）可預測性LNPs優化

區別于高通量篩選，如果給出明確的LNPs設計原則，則會大大縮短研發周期，提高研發效率。Daniel Siegwart課題組2020年在Nature Nanotechnology上報道了一種可預測性設計的LNPs研發技術，命名為SORT。在原有4組分LNPs基礎上，僅添加一種帶有不同電荷的新脂質分子（SORT分子），則可實現mRNA在小鼠的肝臟、脾臟、肺部的靶向遞送和基因編輯。通過增加陽離子脂質能夠使mRNA特異遞送進入肺部；陰離子脂質能夠使mRNA特異進入脾臟；而可離子化陽離子脂質則會增強肝臟的靶向遞送。重要的是，SORT技術具有普適性，可在多種類型的LNPs基礎上快速研發出肝外器官靶向LNPs。進一步機制探究發現，SORT分子可調控SORT-LNPs在器官水平的生物分布、LNPs自身pka、及表面血清蛋白冠等，這些因素最終決定了LNPs在體內的靶向遞送能力。文中指出，在器官靶向遞送方面，LNPs表面的血清蛋白冠起到最關鍵作用，識別這些獨特的蛋白質可能會在未來研發靶向其他器官的LNPs方面有所幫助。

圖1. 體內靶向遞送mRNA-LNPs的研發策略。

總結與展望
器官(guan)(guan)選(xuan)擇性遞送對(dui)(dui)于(yu)拓寬mRNA臨(lin)床(chuang)應用至關重(zhong)要(yao)。本文提到的幾種代表性策(ce)略在一(yi)定(ding)程(cheng)度(du)上(shang)提出了解(jie)決方案，但各有不足之處。如(ru)何開(kai)發(fa)出靶(ba)向其他重(zhong)要(yao)器官(guan)(guan)（如(ru)心臟(zang)、胰腺、腎臟(zang)）的LNPs、如(ru)何實現對(dui)(dui)特定(ding)臟(zang)器中特定(ding)細(xi)胞類型(xing)的靶(ba)向遞送都是未來(lai)(lai)(lai)需要(yao)解(jie)決的重(zhong)要(yao)問(wen)題。隨(sui)著(zhu)研(yan)究(jiu)人員(yuan)對(dui)(dui)mRNA靶(ba)向遞送技(ji)術(shu)的深入(ru)研(yan)究(jiu)，相信未來(lai)(lai)(lai)會有更(geng)多的靶(ba)向遞送策(ce)略研(yan)發(fa)出來(lai)(lai)(lai)用于(yu)精準醫(yi)療研(yan)究(jiu)。

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原(yuan)文鏈接：//doi.org/10.1093/lifemedi/lnac004