核酸脂質體納米粒LNP介紹及其制備方法

1. 什么是核酸脂質體納米粒LNP

脂(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)體（Liposome）最早在(zai)(zai)1961年由(you)(you)科學(xue)家Alec Douglas. Bangham 和(he) R. W. Horne在(zai)(zai)顯微鏡下發現。脂(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)體是由(you)(you)脂(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)分子組(zu)成的囊泡結構，其脂(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)雙分子層形成疏(shu)水(shui)外殼和(he)內部的水(shui)相空(kong)腔，兼(jian)具親水(shui)和(he)疏(shu)水(shui)特性。脂(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)納(na)米(mi)粒(li)（Lipid Nanoparticle，LNP）是使用脂(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)形成納(na)米(mi)微粒(li)的一種。在(zai)(zai)過(guo)去，科研人員通常(chang)使用脂(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)納(na)米(mi)粒(li)直(zhi)接包裹化學(xue)藥物，在(zai)(zai)基因(yin)治療領(ling)域(yu)，研究人員開(kai)始(shi)使用脂(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)納(na)米(mi)粒(li)包裹核酸，如mRNA、siRNA、pDNA等，稱(cheng)為(wei)核酸脂(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)納(na)米(mi)粒(li)。

針對Covid-19新(xin)(xin)型(xing)(xing)冠(guan)狀(zhuang)病(bing)毒(du)的(de)mRNA疫苗開發，從(cong)(cong)病(bing)毒(du)序列到成功上市只(zhi)用(yong)了短短一(yi)年不到的(de)時間。這在從(cong)(cong)前是無(wu)法想象(xiang)和(he)實(shi)現的(de)。在這次針對Covid-19新(xin)(xin)型(xing)(xing)冠(guan)狀(zhuang)病(bing)毒(du)的(de)mRNA疫苗上，莫德納(Moderna)采用(yong)了自主開發的(de)可(ke)電(dian)離(li)脂質(zhi)SM-102，而輝(hui)瑞(rui)和(he)BioNTech則從(cong)(cong)Acuitas公司(si)獲(huo)得(de)了一(yi)種名為(wei)ALC-0315的(de)可(ke)電(dian)離(li)脂質(zhi)的(de)許可(ke)。

mRNA分子由于疫(yi)苗(miao)(miao)的(de)(de)關系為大眾所(suo)認識，但是(shi)很多人(ren)卻(que)不知道mRNA疫(yi)苗(miao)(miao)的(de)(de)幕后功臣(chen)，甚(shen)至可(ke)以說是(shi)整個(ge)機理的(de)(de)關鍵所(suo)在，是(shi)將mRNA封裝并(bing)(bing)且(qie)安全有效地(di)送進機體細(xi)胞的(de)(de)脂質納米(mi)(mi)粒（Lipid Nanoparticle，LNP）。從技(ji)術上來講，核酸藥物的(de)(de)研發(fa)主(zhu)要有三個(ge)壁壘(lei)：第(di)(di)(di)一(yi)個(ge)是(shi)原(yuan)料端，包括mRNA原(yuan)料序(xu)列的(de)(de)篩選(xuan)和修飾；第(di)(di)(di)二個(ge)是(shi)遞送系統；第(di)(di)(di)三個(ge)是(shi)整個(ge)藥物的(de)(de)生產工藝。目前(qian)采(cai)(cai)用微(wei)流控技(ji)術產生脂質納米(mi)(mi)顆粒（LNP）， 將mRNA包裹在LNP 納米(mi)(mi)顆粒中，再(zai)進入人(ren)體, 是(shi)FDA唯一(yi)批準上市的(de)(de)mRNA傳遞技(ji)術，并(bing)(bing)且(qie)已(yi)(yi)經(jing)在世界各地(di)注射上億劑的(de)(de)mRNA新冠(guan)疫(yi)苗(miao)(miao)中采(cai)(cai)用，其(qi)技(ji)術的(de)(de)安全性(xing)和有效性(xing)已(yi)(yi)經(jing)在這次全球的(de)(de)新冠(guan)疫(yi)情(qing)中得到驗證。

 

2. 核酸(suan)脂質體納米粒LNP的(de)作用機理(li)

在包裹核(he)酸的脂(zhi)(zhi)質納(na)米(mi)粒配方中(zhong)，起關鍵作用的是可電(dian)(dian)離(li)脂(zhi)(zhi)質。例如Onpattro中(zhong)的Dlin-MC3-DMA（簡(jian)稱(cheng)MC3），其pKa值在6.3-6.5 之間，這個特(te)性(xing)讓它在血清的環境中(zhong)表面(mian)電(dian)(dian)荷(he)基本(ben)為中(zhong)性(xing)，有(you)利于細胞(bao)(bao)將帶有(you)核(he)酸片(pian)段的脂(zhi)(zhi)質納(na)米(mi)粒整個吞進(jin)(jin)細胞(bao)(bao)內，形(xing)成(cheng)胞(bao)(bao)內體（endosome）。 一旦進(jin)(jin)入細胞(bao)(bao)后，胞(bao)(bao)內體的酸性(xing)環境使電(dian)(dian)離(li)脂(zhi)(zhi)質的頭部(bu)質子化并帶正(zheng)電(dian)(dian)荷(he)，從而與胞(bao)(bao)內體的內膜融合(he)，釋放(fang)目標核(he)酸到細胞(bao)(bao)中(zhong)發(fa)揮作用。

 

圖1 核酸脂質體納米粒LNP的作用(yong)機(ji)理

 

3. 核(he)酸脂質體納米粒LNP制備方法

最適合(he)(he)的(de)(de)技(ji)術(shu)(shu)還是采用(yong)微流控(kong)混(hun)合(he)(he)技(ji)術(shu)(shu)來制備核(he)酸脂質(zhi)納米粒(li)(li)，該方法相(xiang)對簡便(bian)快(kuai)速(su)(su)(su)，條件溫和(he)，同(tong)時(shi)容易(yi)實現生產放(fang)大。微流控(kong)技(ji)術(shu)(shu)基本(ben)原理：將脂質(zhi)與核(he)酸分(fen)別溶(rong)解(jie)(jie)在水相(xiang)和(he)有機相(xiang)后，將兩(liang)相(xiang)溶(rong)液(ye)注入(ru)制備系統的(de)(de)兩(liang)條入(ru)口(kou)通道，一(yi)端是RNA的(de)(de)水溶(rong)液(ye)，一(yi)端是脂質(zhi)的(de)(de)乙(yi)醇(chun)溶(rong)液(ye)，通過兩(liang)相(xiang)的(de)(de)快(kuai)速(su)(su)(su)混(hun)合(he)(he)，完(wan)成(cheng)核(he)酸脂質(zhi)納米顆(ke)粒(li)(li)的(de)(de)合(he)(he)成(cheng)。 改(gai)變流體(ti)注入(ru)速(su)(su)(su)度(du)和(he)比率，可(ke)以(yi)控(kong)制脂質(zhi)納米顆(ke)粒(li)(li)的(de)(de)粒(li)(li)徑大小。將各種脂質(zhi)溶(rong)解(jie)(jie)在乙(yi)醇(chun)中(zhong)(zhong)，mRNA溶(rong)于(yu)酸性(xing)水緩(huan)沖液(ye)中(zhong)(zhong)，將兩(liang)相(xiang)快(kuai)速(su)(su)(su)混(hun)合(he)(he)。通過稀釋(shi)乙(yi)醇(chun)相(xiang)，脂質(zhi)的(de)(de)溶(rong)解(jie)(jie)度(du)降低，在混(hun)合(he)(he)溶(rong)液(ye)中(zhong)(zhong)逐漸(jian)析(xi)出凝固并形成(cheng)脂質(zhi)納米粒(li)(li)，同(tong)時(shi)高(gao)效包(bao)載mRNA。再經緩(huan)沖液(ye)膜包(bao)超濾或者透析(xi)除(chu)去殘留的(de)(de)乙(yi)醇(chun)，中(zhong)(zhong)和(he)緩(huan)沖液(ye)的(de)(de)pH值。

 

4. 制備核酸脂(zhi)質(zhi)體納米粒LNP的微流控芯片結構(gou)

利用微流(liu)(liu)控(kong)芯片技術制(zhi)(zhi)備核酸脂質(zhi)體(ti)納(na)米粒LNP主(zhu)要是實現充分的(de)混合(he)，常采(cai)用魚骨結(jie)構。芯片中魚骨結(jie)構區域使流(liu)(liu)經的(de)液(ye)體(ti)產(chan)生(sheng)混沌流(liu)(liu)動，大大提高(gao)了液(ye)體(ti)的(de)混合(he)效率，比(bi)傳統的(de)攪拌混合(he)均一(yi)性好，從而(er)在(zai)芯片的(de)出口處快速產(chan)生(sheng)均勻(yun)的(de)流(liu)(liu)體(ti)。其(qi)中的(de)魚骨結(jie)構可(ke)(ke)以(yi)是凸起（如圖(tu)2所示），也可(ke)(ke)以(yi)是凹陷(xian)（如圖(tu)3所示），制(zhi)(zhi)備效果跟體(ti)系(xi)有關，其(qi)粒徑(jing)大小主(zhu)要跟流(liu)(liu)速比(bi)有關。

 

圖2 魚骨(gu)結(jie)構凸起

圖(tu)3 魚骨結構凹(ao)陷

 

目前高(gao)校研究所及部分公司客戶尚處(chu)在核酸(suan)脂(zhi)質體(ti)納米粒LNP的配方開發階段，常選用帶(dai)魚骨(gu)結構的PDMS芯片(pian)進行研究，一(yi)方面是因為PDMS材質的芯片(pian)加工周(zhou)期短(duan)，成本低(di)，另(ling)一(yi)方面是因為PDMS芯片(pian)的特性使得實(shi)驗參數更(geng)易獲得。以(yi)下3款核酸(suan)脂(zhi)質體(ti)納米粒LNP制備(bei)微流控芯片(pian)是研究者經常使用的。

 

圖4 ZX-LS-11核酸脂質體(ti)納米粒(li)LNP制備芯片(pian)（魚骨結構凸起）

圖5 ZX-LS-31核酸脂質體納(na)米粒LNP制備芯(xin)片(pian)（魚骨結構凹(ao)陷(xian)）

圖6 ZX-LS-31P核酸脂質(zhi)體納(na)米粒LNP制備芯片（魚骨結構凹陷）

圖(tu)7 魚骨(gu)結構(gou)核酸脂質體納米(mi)粒(li)LNP制備(bei)芯片實物圖(tu)（PDMS微(wei)流控(kong)芯片）

 

5. 制(zhi)備核酸脂質(zhi)體納米粒LNP的進樣設備

中芯(xin)啟(qi)恒(heng)恒(heng)壓(ya)泵（壓(ya)力驅動微流(liu)體(ti)進(jin)樣(yang)儀）用(yong)于(yu)生(sheng)成穩(wen)定無脈沖的液流(liu)，其響(xiang)應時間短，適(shi)用(yong)于(yu)各種要求苛刻(ke)的微流(liu)體(ti)應用(yong)。壓(ya)力控制(zhi)器由計算(suan)機(ji)通過 USB 接口控制(zhi)，使用(yong)中芯(xin)啟(qi)恒(heng) FluidicLab Suite 軟件，可以生(sheng)成復(fu)雜的壓(ya)力或流(liu)速曲線 ( 如正弦波(bo)，方波(bo)，三角波(bo)等 )。配套(tao)的中芯(xin)啟(qi)恒(heng)FluidicLab Suite 軟件可記錄(lu)并輸出壓(ya)力控制(zhi)器產(chan)生(sheng)的數(shu)據。

 

圖8 中芯啟(qi)恒恒壓泵(beng)連接示意圖

 

將壓(ya)力控制器 1 通道與(yu)(yu) 4 mm PU 管(guan)(guan)(guan)一端(duan)連接，然后把連接儲液(ye)池(chi)(chi)的(de) PTFE 管(guan)(guan)(guan)與(yu)(yu)流(liu)量傳感(gan)器的(de)“in”接口相(xiang)連，流(liu)量傳感(gan)器的(de)另一端(duan)“out”連接 PTFE 管(guan)(guan)(guan)作為液(ye)體輸出口，最終組裝出設備如圖1所示。其余3個通道的(de)連接與(yu)(yu)之相(xiang)同(tong)。進(jin)樣原理是：以(yi)氣推(tui)液(ye)，氣體管(guan)(guan)(guan)在(zai)儲液(ye)池(chi)(chi)頁面以(yi)上，出液(ye)管(guan)(guan)(guan)在(zai)儲液(ye)池(chi)(chi)液(ye)面以(yi)下，氣體擠(ji)(ji)壓(ya)液(ye)面，將液(ye)體從出液(ye)管(guan)(guan)(guan)擠(ji)(ji)出，實現進(jin)樣操作。

 

5.1 恒壓泵（壓力驅(qu)動微流(liu)體進樣(yang)儀）特點：

壓力輸出波動小于 0.02% ，響應時間 9 ms，無論恒流輸出還是變流 速輸出，均可應對自如。
卓越的性能：
1）內置壓力傳感器，高速 PID 控制，壓力輸出波動：< 0.02%
2） 響應時間：< 9 ms
3）可安裝四個獨立的壓力輸出通道 多種壓力輸出范圍（0-0.2 bar，0-2 bar, 0-8 bar, -1-1 bar, -1-6 bar)，并可根據客 戶要求定制
4）可設置恒流輸出（需接流量傳感器）和壓力波形輸出

 

5.2 壓力控制器軟件的使用(yong)：

圖9中(zhong)芯啟(qi)恒恒壓泵壓力(li)控制(zhi)窗(chuang)口

 

如圖9所示，可以直接設置(zhi)各通道(dao)的(de)壓(ya)力參數(shu)，每個通道(dao)的(de)壓(ya)力參數(shu)可以設置(zhi)不同。

 

圖10中芯啟恒恒壓泵壓力控(kong)制設(she)置窗口

 

如(ru)圖10所示，用戶可(ke)以設(she)置(zhi)實(shi)(shi)時(shi)壓力的(de)讀取(qu)間(jian)隔，其(qi)最低(di)設(she)定值為(wei) 0.001s ( 實(shi)(shi)測讀取(qu)時(shi)最短讀取(qu)周期約(yue)為(wei) 0.02 s，低(di)于此(ci)間(jian)隔的(de)數據是重復的(de) )。備注信息，壓力校準(zhun)和同(tong)步增(zeng)減(jian)系數設(she)置(zhi)（多路壓力協(xie)同(tong)輸出）也可(ke)以在此(ci)操作。

 

6. 制備的核酸脂質體納米粒LNP的粒徑范圍

如圖11所示，利(li)用帶魚骨(gu)結構的微流(liu)控芯片制備的核酸脂質體納米粒LNP平均粒徑在142nm左右。

圖(tu)11 制備的核酸脂質體納(na)米粒LNP的粒徑范(fan)圍(wei)