概(gai)要：脂質納米顆粒（LNPs）是一種具有均勻脂質核的脂囊泡，被廣泛應用于小分子藥物和核酸輸送，最近因為在COVID-19 mRNA疫苗遞送平臺取得的顯著成功引起了廣泛的關注。然而，mRNA誘導的短暫蛋白表達的應用并不僅僅用于傳染性疾病的疫苗領域，也為癌癥疫苗、蛋白質替代療法和罕見遺傳疾病的基因編輯組件提供了新的途徑。然而，未包覆的mRNA本身并不穩定，很容易由于核酸酶和自水解快速降解。經LNPs包覆的mRNA可以免受細胞外核糖核酸酶的影響，并有助于細胞內mRNA的遞送。在(zai)這篇文章中，我們將討論RNA遞送(song)所(suo)使用LNPs的(de)核(he)心特征。本(ben)文將聚焦于(yu)mRNA遞送(song)用LNPs；然而(er)，也相應地(di)列舉了siRNA-LNP遞送(song)的(de)例子，以突出核(he)酸結(jie)構(gou)造成的(de)共性和(he)差異。首先，將介紹LNPs的(de)(de)(de)概念，利用(yong)(yong)核(he)(he)酸作(zuo)為治療藥(yao)物的(de)(de)(de)優點和(he)(he)(he)缺點，以及LNPs分(fen)子(zi)構成(cheng)的(de)(de)(de)一(yi)般推(tui)理(li)；同時簡(jian)要介紹了(le)(le)臨(lin)床(chuang)上基(ji)于LNPs的(de)(de)(de)核(he)(he)酸治療的(de)(de)(de)最新成(cheng)功經驗(yan)。其次，闡述了(le)(le)LNP自組裝的(de)(de)(de)理(li)論(lun)和(he)(he)(he)方(fang)法。所有(you)(you)制(zhi)備方(fang)法的(de)(de)(de)共同理(li)念是誘導核(he)(he)酸和(he)(he)(he)帶電(dian)脂質(zhi)之(zhi)間的(de)(de)(de)靜(jing)電(dian)相互作(zuo)用(yong)(yong)，并通過疏水作(zuo)用(yong)(yong)促(cu)進納米顆粒(li)的(de)(de)(de)生長。第三，根據基(ji)本性(xing)(xing)(xing)質(zhi)和(he)(he)(he)用(yong)(yong)途(tu)對LNP進行成(cheng)分(fen)分(fen)解，包括公認的(de)(de)(de)分(fen)子(zi)設計標準、商(shang)業(ye)來源，對細(xi)胞(bao)(bao)內運輸的(de)(de)(de)影(ying)響，以及對LNPs性(xing)(xing)(xing)能的(de)(de)(de)貢(gong)獻。LNPs的(de)(de)(de)關(guan)鍵成(cheng)分(fen)之(zhi)一(yi)是啟(qi)動與(yu)內吞體膜(mo)的(de)(de)(de)靜(jing)電(dian)結(jie)合(he)、并促(cu)進胞(bao)(bao)質(zhi)釋放的(de)(de)(de)可電(dian)離(li)脂質(zhi)；然而，其他脂質(zhi)成(cheng)分(fen)的(de)(de)(de)作(zuo)用(yong)(yong)也不應忽(hu)視(shi)，因為它們與(yu)LNPs的(de)(de)(de)穩定性(xing)(xing)(xing)、間隙和(he)(he)(he)分(fen)布(bu)密切相關(guan)。第四，從整體上回顧了(le)(le)對RNA遞送有(you)(you)重要影(ying)響的(de)(de)(de)LNP結(jie)構屬(shu)性(xing)(xing)(xing)，包括LNP的(de)(de)(de)尺寸、電(dian)荷(he)、內部(bu)結(jie)構、脂質(zhi)封裝、脂膜(mo)水合(he)作(zuo)用(yong)(yong)、穩定性(xing)(xing)(xing)和(he)(he)(he)對生物大分(fen)子(zi)的(de)(de)(de)親和(he)(he)(he)性(xing)(xing)(xing)；還將討論(lun)這(zhe)些屬(shu)性(xing)(xing)(xing)的(de)(de)(de)檢(jian)測技術以及調控方(fang)法。最(zui)后，展(zhan)望了RNA療法的(de)未來，并提出(chu)了LNP配方和優化領域中存在的(de)一些(xie)問題(ti)。

 

1.引言

近年來，脂(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)納(na)米顆(ke)粒（LNPs）顯(xian)示其在RNA疫苗和療(liao)法(fa)中作(zuo)為遞送系統的(de)(de)(de)(de)的(de)(de)(de)(de)實用性(xing)。無(wu)包(bao)覆的(de)(de)(de)(de)RNA是(shi)一(yi)種帶負電荷的(de)(de)(de)(de)親水大分(fen)子(zi)，由于細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)膜(mo)(mo)的(de)(de)(de)(de)靜(jing)電排斥，很(hen)難進(jin)入細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)，并被無(wu)所不在的(de)(de)(de)(de)核(he)糖核(he)酸(suan)酶（RNase）迅速(su)降解。因(yin)此(ci)，它需(xu)要(yao)一(yi)個(ge)(ge)保護層以(yi)增加進(jin)入細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)內部(bu)機會(hui)。由于細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)膜(mo)(mo)主要(yao)由脂(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)構成(cheng)，因(yin)此(ci)，使用脂(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)體包(bao)覆RNA可(ke)(ke)以(yi)使RNA更容易通(tong)過(guo)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)膜(mo)(mo)并將其釋放到細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)質(zhi)中。為了(le)(le)實現(xian)這個(ge)(ge)目(mu)的(de)(de)(de)(de)，脂(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)體首先(xian)需(xu)要(yao)一(yi)個(ge)(ge)帶正電的(de)(de)(de)(de)脂(zhi)(zhi)(zhi)粒，可(ke)(ke)以(yi)附著在帶負電的(de)(de)(de)(de)RNA上。然而，由永久性(xing)陽(yang)離子(zi)脂(zhi)(zhi)(zhi)粒組(zu)成(cheng)的(de)(de)(de)(de)脂(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)體會(hui)對(dui)帶負電荷的(de)(de)(de)(de)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)膜(mo)(mo)產生(sheng)靜(jing)電破壞(huai)從而引起細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)毒性(xing)。因(yin)此(ci)，脂(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)結(jie)構被進(jin)一(yi)步(bu)改進(jin)，通(tong)過(guo)酸(suan)性(xing)內溶酶體途徑(jing)獲得正電荷；LNP成(cheng)分(fen)也(ye)擴(kuo)展到了(le)(le)結(jie)構脂(zhi)(zhi)(zhi)類(lei)(lei)(lei)（模擬(ni)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)膜(mo)(mo)并屏蔽(bi)正電荷）和聚（乙二(er)醇(chun)）-錨定脂(zhi)(zhi)(zhi)類(lei)(lei)(lei)（防止LNPs聚集(ji)以(yi)及與(yu)生(sheng)物環境的(de)(de)(de)(de)副(fu)反(fan)應）。從FDA批準了(le)(le)首個(ge)(ge)siRNA-LNP藥物（Onpattro）和mRNA-LNP新(xin)冠疫苗（Comirnaty）以(yi)及Moderna新(xin)冠疫苗的(de)(de)(de)(de)緊(jin)急使用授權（EUA）等這些(xie)該(gai)領(ling)域的(de)(de)(de)(de)主要(yao)監(jian)管里程碑事(shi)件可(ke)(ke)以(yi)明(ming)顯(xian)看出，基于LNP的(de)(de)(de)(de)核(he)酸(suan)遞送方法(fa)是(shi)安全的(de)(de)(de)(de)，適用于各種療(liao)法(fa)。然而，目(mu)前還(huan)沒有適合所有疾病的(de)(de)(de)(de)萬能方案，因(yin)此(ci)LNP的(de)(de)(de)(de)優化工作(zuo)依舊任(ren)重道(dao)遠。本文將討(tao)論用于選擇(ze)RNA-LNP遞送脂(zhi)(zhi)(zhi)類(lei)(lei)(lei)所需(xu)的(de)(de)(de)(de)主要(yao)科學和制造概念。

2.制備

LNP的(de)(de)(de)(de)(de)制(zhi)備(bei)依賴于自(zi)組裝(zhuang)(zhuang)(zhuang)能力(li)，即脂質成(cheng)分在分子間(jian)相(xiang)互作(zuo)用的(de)(de)(de)(de)(de)基(ji)礎上(shang)自(zi)發組裝(zhuang)(zhuang)(zhuang)成(cheng)納米實體(ti)。LNP的(de)(de)(de)(de)(de)形成(cheng)從帶(dai)負(fu)電(dian)荷的(de)(de)(de)(de)(de)核(he)酸和帶(dai)正電(dian)荷的(de)(de)(de)(de)(de)脂類(lei)之間(jian)的(de)(de)(de)(de)(de)靜電(dian)結合開(kai)始(shi)。然后，LNPs通過疏(shu)水性(xing)(xing)和脂質組分之間(jian)相(xiang)互作(zuo)用的(de)(de)(de)(de)(de)范德華(hua)力(li)增長。由于脂質的(de)(de)(de)(de)(de)多(duo)樣性(xing)(xing)、核(he)酸的(de)(de)(de)(de)(de)獨特性(xing)(xing)及兩者(zhe)混(hun)合過程的(de)(de)(de)(de)(de)瞬(shun)時性(xing)(xing)，對自(zi)組裝(zhuang)(zhuang)(zhuang)的(de)(de)(de)(de)(de)早(zao)期(qi)階(jie)段及其(qi)對LNP最終(zhong)性(xing)(xing)質的(de)(de)(de)(de)(de)相(xiang)關影響的(de)(de)(de)(de)(de)表征仍然極具挑戰。此(ci)外，LNP制(zhi)造協(xie)議至少在兩個方面影響產品的(de)(de)(de)(de)(de)自(zi)組裝(zhuang)(zhuang)(zhuang): LNPs的(de)(de)(de)(de)(de)均勻性(xing)(xing)和核(he)酸負(fu)載效率。

LNP有多(duo)種制(zhi)備(bei)方(fang)法(fa)(fa)，如(ru)脂膜泡擠出(chu)法(fa)(fa)、脂膜再水(shui)化、納(na)米(mi)沉淀法(fa)(fa)和微(wei)(wei)流體(ti)混(hun)(hun)(hun)合法(fa)(fa)。然而(er)，通(tong)常的(de)(de)制(zhi)備(bei)方(fang)法(fa)(fa)是將(jiang)水(shui)和脂質(zhi)(zhi)組(zu)分(fen)快速混(hun)(hun)(hun)合。微(wei)(wei)流控(kong)技術以(yi)其(qi)良好的(de)(de)重(zhong)復(fu)性而(er)成(cheng)為當前(qian)臨(lin)床前(qian)研究的(de)(de)首選方(fang)法(fa)(fa)。新型微(wei)(wei)流控(kong)設備(bei)制(zhi)造取得的(de)(de)進展使這(zhe)種方(fang)法(fa)(fa)更容易(yi)實現，采(cai)用平(ping)行微(wei)(wei)流體(ti)通(tong)道(dao)(dao)或改進的(de)(de)傳統方(fang)法(fa)(fa)（如(ru)移液管(guan)混(hun)(hun)(hun)合和t型混(hun)(hun)(hun)合器）等(deng)(deng)其(qi)他途徑(jing)也可(ke)以(yi)實現LNPs的(de)(de)高(gao)通(tong)量制(zhi)備(bei)。一(yi)般來講，微(wei)(wei)流體(ti)混(hun)(hun)(hun)合有利于(yu)將(jiang)親水(shui)性部(bu)(bu)分(fen)封裝(zhuang)到(dao)疏(shu)水(shui)的(de)(de)脂質(zhi)(zhi)核心中，但這(zhe)一(yi)過程并不(bu)能嚴格需(xu)要核酸(suan)的(de)(de)參與。Kulkarni等(deng)(deng)報道(dao)(dao)，只要脂質(zhi)(zhi)核心形成(cheng)，LNPs可(ke)以(yi)在(zai)T型混(hun)(hun)(hun)合器內與siRNA完成(cheng)組(zu)裝(zhuang)。總(zong)的(de)(de)來說，混(hun)(hun)(hun)合方(fang)式的(de)(de)特性可(ke)能會影(ying)響LNPs的(de)(de)組(zu)裝(zhuang)效率和內部(bu)(bu)結構(gou)，而(er)自組(zu)裝(zhuang)過程的(de)(de)動(dong)力學因數則會決定最終的(de)(de)納(na)米(mi)結構(gou)。

3.配(pei)方

3.1陽離子和(he)可電離脂質(zhi)

陽離子脂質（CLs）和(he)可電(dian)離脂質（ILs）通(tong)過(guo)靜電(dian)相互作用(yong)啟動自(zi)組(zu)裝的(de)第一步(bu)。含有CLs的(de)脂質體仍被廣(guang)泛用(yong)于(yu)核(he)酸遞(di)(di)送(song)。然而，由于(yu)毒(du)(du)性(xing)(xing)(xing)問題和(he)缺(que)乏體內療效，它們已(yi)被對pH敏感的(de)ILs所取代。當被配制成LNPs時(shi)，ILs被設計成在(zai)(zai)生理pH下(xia)顯示電(dian)中性(xing)(xing)(xing)，但在(zai)(zai)酸性(xing)(xing)(xing)核(he)內體內則表現(xian)為帶(dai)正電(dian)荷。這(zhe)種pH適(shi)應的(de)電(dian)離性(xing)(xing)(xing)使其功(gong)效提(ti)升同時(shi)毒(du)(du)性(xing)(xing)(xing)降低(di)，從(cong)而更適(shi)合(he)于(yu)核(he)酸遞(di)(di)送(song)。這(zhe)些脂類通(tong)常(chang)占配方中總脂類的(de)30-50%。許多研(yan)究(jiu)致力(li)于(yu)微(wei)調ILs的(de)屬性(xing)(xing)(xing)，以進一步(bu)提(ti)高(gao)效率，特別(bie)是(shi)在(zai)(zai)難以觸(chu)及的(de)組(zu)織(zhi)。CLs和(he)ILs的(de)整體結構(gou)可以分為三個部(bu)分：（1）頭基(ji)、（2）連接(jie)體及（3）尾部(bu)（圖1）。

圖1 CLs和(he)ILs結構(gou)及組件（頭(tou)基、連接體及尾部）示(shi)意圖

頭(tou)基(ji)(ji) ILs的(de)(de)頭(tou)基(ji)(ji)通常(chang)帶正(zheng)電荷。頭(tou)基(ji)(ji)的(de)(de)大小和電荷密度對核(he)酸(suan)包覆、LNP穩(wen)定、與細胞膜相互作(zuo)用以及(ji)促進核(he)內體中(zhong)的(de)(de)釋放有(you)重要作(zuo)用。ILs也可(ke)能(neng)(neng)有(you)多個(ge)可(ke)電離的(de)(de)頭(tou)基(ji)(ji)，盡管(guan)通常(chang)情況下只(zhi)有(you)一(yi)個(ge)。典型(xing)的(de)(de)基(ji)(ji)包括胺（從一(yi)級到四級）、胍和雜環群 （見(jian)圖(tu)1）。臨(lin)床應用的(de)(de)ILs（DLin-MC3-DMA、SM-102和ALC-0315；見(jian)圖(tu)2）包含具有(you)pH適應電離性的(de)(de)叔胺頭(tou)基(ji)(ji)。ALC-0315和SM-102頭(tou)基(ji)(ji)中(zhong)也含有(you)末端羥基(ji)(ji)，可(ke)以減(jian)少(shao)頭(tou)基(ji)(ji)的(de)(de)水合作(zuo)用，并提高其與核(he)酸(suan)的(de)(de)氫鍵作(zuo)用，可(ke)能(neng)(neng)會提高轉染能(neng)(neng)力(li)。

圖2 特定(ding)ILs結構及cpKa和(he)cLogP值(zhi)

 

連接(jie)(jie)體(ti)(ti) 連接(jie)(jie)體(ti)(ti)通常連接(jie)(jie)頭基(ji)與尾(wei)部，也(ye)可(ke)(ke)(ke)(ke)能包(bao)含(han)(han)在尾(wei)部內(nei)（SM-102和(he)(he)ALC-0315；見圖2）。連接(jie)(jie)體(ti)(ti)會影響(xiang)LNPs的(de)(de)(de)穩定(ding)(ding)性(xing)、生(sheng)物(wu)降(jiang)解(jie)(jie)(jie)性(xing)、細(xi)胞毒性(xing)和(he)(he)轉染效率。在CLs和(he)(he)ILs設(she)計中使用(yong)的(de)(de)(de)常用(yong)連接(jie)(jie)器如圖1所(suo)示。ILs可(ke)(ke)(ke)(ke)能包(bao)含(han)(han)一個(ge)或多個(ge)連接(jie)(jie)體(ti)(ti)；然而(er)，為了便于合(he)成(cheng)，大(da)多數ILs只含(han)(han)有一種類(lei)(lei)型(xing)的(de)(de)(de)連接(jie)(jie)體(ti)(ti)。連接(jie)(jie)體(ti)(ti)可(ke)(ke)(ke)(ke)分為不可(ke)(ke)(ke)(ke)生(sheng)物(wu)降(jiang)解(jie)(jie)(jie)型(xing)（如醚類(lei)(lei)和(he)(he)氨基(ji)甲酸酯(zhi)(zhi)(zhi)類(lei)(lei)）和(he)(he)可(ke)(ke)(ke)(ke)生(sheng)物(wu)降(jiang)解(jie)(jie)(jie)型(xing)（如酯(zhi)(zhi)(zhi)類(lei)(lei)、酰胺類(lei)(lei)和(he)(he)硫醇類(lei)(lei)）。生(sheng)物(wu)可(ke)(ke)(ke)(ke)降(jiang)解(jie)(jie)(jie)連接(jie)(jie)體(ti)(ti)由(you)于可(ke)(ke)(ke)(ke)在體(ti)(ti)內(nei)被(bei)(bei)快速清除(chu)，通常被(bei)(bei)作(zuo)為首選，以確保多次(ci)給(gei)藥并減少(shao)潛在的(de)(de)(de)副(fu)作(zuo)用(yong)。值(zhi)得(de)注意的(de)(de)(de)是，DLin-MC3-DMA，ALC-0315和(he)(he)SM-102都含(han)(han)有酯(zhi)(zhi)(zhi)類(lei)(lei)連接(jie)(jie)體(ti)(ti)。對于SM-102，酯(zhi)(zhi)(zhi)基(ji)團周圍的(de)(de)(de)修(xiu)飾被(bei)(bei)證實會影響(xiang)LNPs的(de)(de)(de)清除(chu)、穩定(ding)(ding)性(xing)和(he)(he)轉染效率。

尾(wei)部(bu) 疏水性(xing)(xing)的(de)尾(wei)部(bu)會影(ying)響(xiang)pKa、親脂性(xing)(xing)、流動性(xing)(xing)和(he)融(rong)合性(xing)(xing)，從而(er)影(ying)響(xiang)納米顆粒的(de)形(xing)(xing)成和(he)效(xiao)力。通常，一(yi)個IL包含1到(dao)4個由8到(dao)20個碳原子組(zu)成的(de)飽(bao)和(he)或不飽(bao)和(he)的(de)疏水性(xing)(xing)尾(wei)部(bu)。不飽(bao)和(he)程度已被證明通過(guo)調節膜不穩(wen)定相關方面影(ying)響(xiang)核酸(suan)的(de)遞送。DLin-MC3-DMA有兩條亞油基(ji)尾(wei)部(bu)，而(er)ALC-0315和(he)SM-102包含兩個假定為錐形(xing)(xing)的(de)分叉(cha)飽(bao)和(he)尾(wei)部(bu)，有助于對核內體膜的(de)去(qu)穩(wen)定作用和(he)核酸(suan)在(zai)細胞溶質(zhi)的(de)釋放(fang)。

ILs可以(yi)(yi)被(bei)看作是(shi)多組分(fen)分(fen)子(zi)，其中的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)每個(ge)(ge)部(bu)分(fen)都需要被(bei)精確設(she)計(ji)，以(yi)(yi)便安全(quan)、高效地包(bao)覆和(he)(he)(he)遞送(song)核酸。從整(zheng)體上理解(jie)ILs的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)特性(xing)也有助(zhu)于(yu)設(she)計(ji)下一(yi)代ILs。這些性(xing)質之一(yi)是(shi)計(ji)算出的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)ILs的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)pKa（cpKa），可以(yi)(yi)很容易地在(zai)硅(gui)中確定。常見ILs的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)cpKa值(zhi)在(zai)9到10.5之間(jian)（圖2）。最(zui)近(jin)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)一(yi)項(xiang)研(yan)(yan)究表明，cpKa極度(du)(du)接近(jin)IL的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)實際pKa. ILs的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)cpKa似乎影響相應LNP配方的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)整(zheng)體pKa，這樣當IL 的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)cpKa大約(yue)是(shi)8.5−10.5時，LNP的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)pKa值(zhi)約(yue)為6−7。IL的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)cpKa和(he)(he)(he)LNP的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)pKa之間(jian)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)差值(zhi)似乎是(shi)固定的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)，約(yue)等(deng)于(yu)2 - 4個(ge)(ge)單(dan)位。因此，cpKa可以(yi)(yi)作為新ILs產品設(she)計(ji)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)指導(dao)工具(ju)。ILs的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)另外(wai)兩(liang)個(ge)(ge)不(bu)太被(bei)關注(zhu)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)性(xing)質是(shi)cLogP和(he)(he)(he)cLogD值(zhi)，它們分(fen)別(bie)代表分(fen)子(zi)在(zai)非(fei)電(dian)離態(tai)和(he)(he)(he)電(dian)離態(tai)下的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)親油(you)性(xing)。在(zai)最(zui)近(jin)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)一(yi)項(xiang)研(yan)(yan)究中，Rajappan等(deng)考(kao)察了(le)pKa、cpKa和(he)(he)(he)cLogD對LNPs遞送(song)siRNA的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)影響，發現cLogD在(zai)10 - 14范(fan)圍內的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)脂質效果最(zui)好。因為一(yi)些常見的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)ILs的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)cLogP值(zhi)在(zai)15−20范(fan)圍內 （圖2），在(zai)設(she)計(ji)下一(yi)代ILs時也應考(kao)慮(lv)其親油(you)性(xing)性(xing)。由于(yu)電(dian)離度(du)(du)（cpKa）和(he)(he)(he)親油(you)性(xing)（cLogP） IL可以(yi)(yi)影響從最(zui)初的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)與核酸形(xing)成復雜結構到最(zui)終納米粒子(zi)形(xing)成以(yi)(yi)及核酸遞送(song)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)整(zheng)個(ge)(ge)流程，在(zai)合成IL前(qian)同時考(kao)慮(lv)這兩(liang)個(ge)(ge)參數可能會極大的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)推動高效IL的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)發現。不(bu)過，需要更多的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)研(yan)(yan)究來(lai)印證這一(yi)觀點。

除了(le)(le)傳統的CLs和ILs外，還有一些(xie)兩(liang)性離子(zi)脂類的例子(zi)。在最(zui)近的一項研究(jiu)中(zhong)，Liu等(deng)人合成了(le)(le)一個名為(wei)iPhos的超過500種兩(liang)性離子(zi)脂質的庫。這些(xie)iPhos由一個胺基、短疏水性尾部和一個磷酸(suan)鹽連接體(ti)組成。研究(jiu)認為(wei)，帶負電荷的磷酸(suan)基促(cu)進了(le)(le)膜融合，并導(dao)致核內(nei)體(ti)釋放。最(zui)優(you)的9A1P9的各種配方可(ke)以(yi)優(you)先(xian)將目標核酸(suan)輸(shu)送到(dao)肝臟和肺部。

綜(zong)上(shang)所述，ILs各(ge)部(bu)分的(de)(de)性質影(ying)響整體(ti)配方(fang)和生(sheng)物(wu)學特性。過去50年間，為設(she)計出理想的(de)(de)IL已經(jing)有了(le)許(xu)多(duo)系(xi)統的(de)(de)研究。其中一些ILs已經(jing)被FDA批(pi)準用于(yu)基因制(zhi)劑的(de)(de)遞送。然(ran)而，設(she)計能夠在非(fei)肝靶上(shang)高(gao)效無毒(du)地輸送不(bu)同類型的(de)(de)基因制(zhi)劑的(de)(de)ILs仍需大量研究。對ILs合成(cheng)有更多(duo)興趣的(de)(de)讀者可以(yi)參考一篇優秀的(de)(de)相關綜(zong)述。

 

3.2固(gu)醇類

圖(tu)3 LNP配(pei)方(fang)中(zhong)使用的固醇（綠(lv)色）、磷(lin)脂（藍色）和PEG脂質 （紅色）舉例

3.3磷脂類(lei)

磷(lin)脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)有(you)(you)助于(yu)(yu)核(he)酸(suan)的(de)(de)(de)(de)(de)封裝和LNPs穩定性(xing)的(de)(de)(de)(de)(de)提(ti)高。與(yu)其他脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)類(lei)成(cheng)(cheng)分(fen)相(xiang)比(bi)(bi)，它們的(de)(de)(de)(de)(de)研(yan)(yan)究相(xiang)對較少(shao)，通(tong)常(chang)只占(zhan)配方中(zhong)(zhong)總脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)類(lei)的(de)(de)(de)(de)(de)10 - 20%。磷(lin)脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)因為可以(yi)自(zi)發地組織成(cheng)(cheng)脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)質雙分(fen)子(zi)層，并且具有(you)(you)較高的(de)(de)(de)(de)(de)相(xiang)變(bian)溫(wen)度(du)從而(er)(er)確(que)保(bao)LNPs的(de)(de)(de)(de)(de)膜(mo)(mo)穩定性(xing)而(er)(er)被用作結(jie)(jie)構(gou)脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)質。磷(lin)脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)位于(yu)(yu)LNPs的(de)(de)(de)(de)(de)外(wai)圍(wei)，就像(xiang)細胞膜(mo)(mo)一樣。這些脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)類(lei)通(tong)常(chang)是(shi)半(ban)合成(cheng)(cheng)的(de)(de)(de)(de)(de)，例如(ru)，磷(lin)脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)酰(xian)(xian)(xian)(xian)膽(dan)堿(jian)通(tong)常(chang)來(lai)(lai)自(zi)蛋黃(huang)和大豆等(deng)(deng)天(tian)然(ran)(ran)來(lai)(lai)源，可以(yi)通(tong)過化學(xue)修飾使其包含(han)脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)肪酸(suan)尾(wei)部。二硬(ying)脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)酰(xian)(xian)(xian)(xian)磷(lin)脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)酰(xian)(xian)(xian)(xian)膽(dan)堿(jian) （DSPC）（見圖3）是(shi)一種(zhong)臨床(chuang)批準(zhun)的(de)(de)(de)(de)(de)LNPs結(jie)(jie)構(gou)脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)質，用于(yu)(yu)如(ru)siRNA治療（Onpattro）和針(zhen)對SARS-CoV-2的(de)(de)(de)(de)(de)mRNA疫(yi)苗。DSPC在(zai)結(jie)(jie)構(gou)上由磷(lin)脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)酰(xian)(xian)(xian)(xian)膽(dan)堿(jian)頭基和兩個(ge)飽(bao)和18碳尾(wei)組成(cheng)(cheng)，形成(cheng)(cheng)一個(ge)緊密堆積的(de)(de)(de)(de)(de)脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)質雙分(fen)子(zi)層。在(zai)LNPs中(zhong)(zhong)，它主要位于(yu)(yu)納米顆粒(li)(li)表(biao)面，同時(shi)在(zai)納米顆粒(li)(li)核(he)中(zhong)(zhong)少(shao)量存在(zai)。二油酰(xian)(xian)(xian)(xian)磷(lin)脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)酰(xian)(xian)(xian)(xian)乙醇胺（DOPE）是(shi)另一種(zhong)經常(chang)用于(yu)(yu)LNPs臨床(chuang)前研(yan)(yan)究的(de)(de)(de)(de)(de)磷(lin)脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)。由于(yu)(yu)尾(wei)部不飽(bao)和，DOPE不僅形成(cheng)(cheng)流動性(xing)更好的(de)(de)(de)(de)(de)脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)質層，而(er)(er)且具有(you)(you)形成(cheng)(cheng)六邊(bian)形II （HII）相(xiang)結(jie)(jie)構(gou)的(de)(de)(de)(de)(de)內在(zai)能力。HII相(xiang)結(jie)(jie)構(gou)被認(ren)為能促進(jin)脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)質膜(mo)(mo)與(yu)核(he)內體膜(mo)(mo)的(de)(de)(de)(de)(de)膜(mo)(mo)融合，進(jin)而(er)(er)使核(he)酸(suan)制劑(ji)在(zai)胞質內釋放。多項(xiang)研(yan)(yan)究表(biao)明，與(yu)DSPC相(xiang)比(bi)(bi)，DOPE可以(yi)提(ti)高率磷(lin)脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)基LNPs中(zhong)(zhong)RNA的(de)(de)(de)(de)(de)轉(zhuan)(zhuan)染效率。近(jin)期，Zhang等(deng)(deng)人報道稱，DOPE可導致C12-200 LNPs在(zai)肝(gan)臟內的(de)(de)(de)(de)(de)聚集(ji)，而(er)(er)DSPC會(hui)導致靜脈給藥時(shi)脾積聚，證明了(le)(le)結(jie)(jie)構(gou)脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)質對LNP生物分(fen)布的(de)(de)(de)(de)(de)影響。我們還發現，用天(tian)然(ran)(ran)糖脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)替代MC3基LNPs中(zhong)(zhong)的(de)(de)(de)(de)(de)DSPC會(hui)影響mRNA轉(zhuan)(zhuan)染，來(lai)(lai)自(zi)植(zhi)物的(de)(de)(de)(de)(de)膜(mo)(mo)脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)--高絲氨酸(suan)（DGTS）（見圖3），可以(yi)根(gen)據給藥途徑表(biao)現出(chu)不同的(de)(de)(de)(de)(de)轉(zhuan)(zhuan)染效率。總之(zhi)，這些研(yan)(yan)究突出(chu)了(le)(le)結(jie)(jie)構(gou)脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)質在(zai)LNPs介導的(de)(de)(de)(de)(de)RNA遞送中(zhong)(zhong)的(de)(de)(de)(de)(de)重要性(xing)。

3.4嵌PEG脂質(zhi)

嵌PEG脂質(zhi)(zhi)（PEG-lipids，見(jian)圖3）是(shi)(shi)控(kong)制(zhi)LNPs半衰期和細(xi)(xi)胞(bao)(bao)攝入的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)一(yi)(yi)個(ge)重要(yao)組成部(bu)分。在(zai)(zai)LNP組裝過(guo)程(cheng)中(zhong)，PEG鏈由于其(qi)親水性(xing)(xing)和大體積(ji)而(er)位于納米顆(ke)粒(li)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)外殼中(zhong)。與(yu)其(qi)他納米載體一(yi)(yi)樣，PEG為(wei)LNPs提供了外部(bu)聚合物層(ceng)，以(yi)(yi)阻礙(ai)血(xue)清(qing)蛋(dan)白(bai)(bai)(bai)和單核吞(tun)噬細(xi)(xi)胞(bao)(bao)系統的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)吸附，延長體內(nei)循環時(shi)間。PEG還可(ke)(ke)以(yi)(yi)防止納米顆(ke)粒(li)在(zai)(zai)儲存過(guo)程(cheng)以(yi)(yi)及血(xue)液中(zhong)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)聚集。此(ci)外，PEG脂質(zhi)(zhi)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)含(han)(han)量(liang)(liang)可(ke)(ke)能(neng)(neng)決(jue)定(ding)(ding)顆(ke)粒(li)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)大小(xiao)。PEG脂質(zhi)(zhi)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)另一(yi)(yi)個(ge)潛在(zai)(zai)用(yong)(yong)途(tu)是(shi)(shi)功能(neng)(neng)化LNP的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)表(biao)面，使(shi)LNPs與(yu)配體或(huo)生(sheng)物大分子(zi)結(jie)合成為(wei)可(ke)(ke)能(neng)(neng)。例如(ru)，Singh等(deng)(deng)(deng)使(shi)用(yong)(yong)DSPE-PEG-胺通過(guo)NHS/EDC化學共軛結(jie)合透明(ming)質(zhi)(zhi)酸來(lai)靶(ba)向治療腫瘤，Parhiz等(deng)(deng)(deng)使(shi)用(yong)(yong)DSPE-PEG-馬來(lai)酰亞胺通過(guo)SATA-馬來(lai)酰亞胺化學共軛結(jie)合抗(kang)體。雖然PEG有(you)助于LNP的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)穩定(ding)(ding)性(xing)(xing)和生(sheng)物偶(ou)聯，但其(qi)解吸對(dui)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)轉染也至關重要(yao)。PEG從LNPs中(zhong)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)脫落(luo)(luo)可(ke)(ke)使(shi)血(xue)清(qing)蛋(dan)白(bai)(bai)(bai)（如(ru)載脂蛋(dan)白(bai)(bai)(bai)和白(bai)(bai)(bai)蛋(dan)白(bai)(bai)(bai)）產生(sheng)調理(li)作(zuo)用(yong)(yong)，這是(shi)(shi)LNPs發生(sheng)受體介導(dao)內(nei)吞(tun)作(zuo)用(yong)(yong)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)關鍵(jian)效(xiao)應物。Akinc等(deng)(deng)(deng)人證明(ming)ApoE與(yu)LNPs結(jie)合后，導(dao)致低密(mi)度(du)(du)脂蛋(dan)白(bai)(bai)(bai)受體（LDLR）介導(dao)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)肝細(xi)(xi)胞(bao)(bao)內(nei)化。由于PEG脂質(zhi)(zhi)抑(yi)制(zhi)ApoE與(yu)LNPs的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)結(jie)合，過(guo)量(liang)(liang)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)PEG 脂質(zhi)(zhi)會對(dui)LNPs的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)攝入和轉染產生(sheng)不(bu)利影響(xiang)。含(han)(han)有(you)較(jiao)少PEG脂質(zhi)(zhi)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)LNPs由于更(geng)容易與(yu)ApoE結(jie)合表(biao)現出更(geng)高的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)酸遞送效(xiao)率。PEG脂類(lei)脂質(zhi)(zhi)錨(mao)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)長度(du)(du)也是(shi)(shi)決(jue)定(ding)(ding)解吸速率的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)重要(yao)因素(su)。Mui等(deng)(deng)(deng)報(bao)道了PEG從LNP的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)脫落(luo)(luo)與(yu)PEG-脂質(zhi)(zhi)錨(mao)定(ding)(ding)長度(du)(du)成反(fan)比(bi)，這是(shi)(shi)因為(wei)PEG-脂質(zhi)(zhi)與(yu)LNP膜之間的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)疏水相互作(zuo)用(yong)(yong)隨著PEG-脂質(zhi)(zhi)錨(mao)定(ding)(ding)長度(du)(du)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)增加(jia)而(er)增加(jia)。Suzuki等(deng)(deng)(deng)提出，PEG脫落(luo)(luo)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)速度(du)(du)也可(ke)(ke)能(neng)(neng)影響(xiang)抗(kang)-PEG抗(kang)體的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)產生(sheng)，并(bing)(bing)反(fan)復給藥會引(yin)起并(bing)(bing)發癥。靜(jing)脈給藥LNP配方(fang)中(zhong)PEG脂質(zhi)(zhi)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)含(han)(han)量(liang)(liang)很少超過(guo)2%；然而(er)，密(mi)集的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)聚乙二醇(chun)層(ceng)可(ke)(ke)能(neng)(neng)有(you)利于達到肝外靶(ba)點。Lee等(deng)(deng)(deng)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)研究(jiu)結(jie)果顯示，相較(jiao)2.5%的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)PEG脂質(zhi)(zhi)含(han)(han)量(liang)(liang)，5%的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)PEG脂質(zhi)(zhi)含(han)(han)量(liang)(liang)時(shi)LNPs在(zai)(zai)腫瘤中(zhong)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)積(ji)累(lei)更(geng)量(liang)(liang)高于，Lokugamage等(deng)(deng)(deng)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)研究(jiu)表(biao)明(ming)，PEG脂質(zhi)(zhi)對(dui)霧化LNPs的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)遞送至關重要(yao)。因此(ci)，LNPs中(zhong)PEG脂質(zhi)(zhi)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)含(han)(han)量(liang)(liang)和種(zhong)類(lei)可(ke)(ke)能(neng)(neng)需要(yao)根據臨床需求謹(jin)慎調整。

4.性(xing)質

LNPs的(de)(de)平均尺寸和(he)(he)尺寸分布(bu)是各種應(ying)用(yong)(yong)中LNP質(zhi)量(liang)和(he)(he)適用(yong)(yong)性的(de)(de)重要初始決(jue)定因素，這些性質(zhi)通(tong)常(chang)用(yong)(yong)動態光散射（DLS）來研(yan)究。一般來說，LNP的(de)(de)最佳尺寸為(wei)20 - 200nm，因為(wei)這個(ge)尺寸使其在流體(ti)（如血液和(he)(he)淋巴）中足夠穩(wen)定，同時能(neng)夠穿過間隙。LNP的(de)(de)尺寸通(tong)常(chang)通(tong)過改變PEG脂質(zhi)的(de)(de)量(liang)或混(hun)合(he)參數（如流速和(he)(he)體(ti)積比）來調節(jie)。LNPs的(de)(de)尺寸可能(neng)會影響其內吞、生物(wu)(wu)分布(bu)、降(jiang)解和(he)(he)清除，不同的(de)(de)應(ying)用(yong)(yong)可能(neng)需要不同的(de)(de)粒徑。例如，45 nm的(de)(de)siRNA LNPs在皮(pi)下給(gei)藥時最有效(xiao)，而80 nm 的(de)(de)siRNA LNPs在小鼠靜脈(mo)給(gei)藥時最有效(xiao)。然而，對嚙齒動物(wu)(wu)和(he)(he)非人靈長類(lei)動物(wu)(wu)中各種粒徑mRNA-LNP的(de)(de)對比表明，非人靈長類(lei)動物(wu)(wu)肌肉注(zhu)射時對LNPs粒徑不太(tai)敏(min)感。

LNP依(yi)靠表(biao)面(mian)電(dian)(dian)荷(he)(he)(he)(he)與細胞(bao)膜(mo)和(he)生(sheng)物環境進行相互作用。由于(yu)細胞(bao)膜(mo)帶(dai)負電(dian)(dian)荷(he)(he)(he)(he)，表(biao)面(mian)帶(dai)負電(dian)(dian)荷(he)(he)(he)(he)的(de)(de)LNPs會被(bei)細胞(bao)膜(mo)排斥從而不(bu)被(bei)細胞(bao)吸收(shou)。另一方面(mian)，帶(dai)正(zheng)電(dian)(dian)荷(he)(he)(he)(he)LNPs可(ke)能(neng)會直(zhi)接破壞細胞(bao)膜(mo)，引起(qi)細胞(bao)毒性(xing)(xing)(xing)。這就(jiu)凸顯了可(ke)電(dian)(dian)離(li)(li)脂(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)在(zai)LNP設計中(zhong)的(de)(de)重要性(xing)(xing)(xing)：最初(chu)，含有(you)可(ke)電(dian)(dian)離(li)(li)脂(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)的(de)(de)LNP是中(zhong)性(xing)(xing)(xing)的(de)(de)，可(ke)以(yi)(yi)避(bi)免任何不(bu)必要的(de)(de)靜電(dian)(dian)相互作用，但(dan)(dan)在(zai)酸性(xing)(xing)(xing)內體pH環境下(xia)會帶(dai)正(zheng)電(dian)(dian)荷(he)(he)(he)(he)。LNPs的(de)(de)表(biao)面(mian)電(dian)(dian)荷(he)(he)(he)(he)通常(chang)用zeta電(dian)(dian)位測(ce)量來評(ping)估(gu)，該技(ji)術通常(chang)用于(yu)評(ping)估(gu)膠體聚集，盡(jin)管沒有(you)嚴格(ge)的(de)(de)分類，但(dan)(dan)如果zeta電(dian)(dian)位落在(zai)-20和(he)+20 mV之(zhi)間(jian)，則認(ren)為表(biao)面(mian)電(dian)(dian)荷(he)(he)(he)(he)較弱(ruo)。調整LNPs總表(biao)面(mian)電(dian)(dian)荷(he)(he)(he)(he)的(de)(de)一種常(chang)見方法是調整N/P比(bi)或者說電(dian)(dian)離(li)(li)脂(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)（N代表(biao)陽離(li)(li)子胺）與核(he)酸（P代表(biao)陰離(li)(li)子磷酸鹽）的(de)(de)比(bi)值(zhi)。Carrasco等認(ren)為，增(zeng)加(jia)含有(you)可(ke)電(dian)(dian)離(li)(li)脂(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)KC2的(de)(de)LNPs中(zhong)的(de)(de)N/P比(bi)可(ke)以(yi)(yi)增(zeng)加(jia)表(biao)面(mian)電(dian)(dian)荷(he)(he)(he)(he)和(he)封裝效率。有(you)趣(qu)的(de)(de)是，在(zai)LNPs中(zhong)加(jia)入永久帶(dai)電(dian)(dian)的(de)(de)脂(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)時可(ke)能(neng)在(zai)不(bu)增(zeng)加(jia)表(biao)面(mian)電(dian)(dian)荷(he)(he)(he)(he)的(de)(de)情況下(xia)改變(bian)優先(xian)攝取的(de)(de)器官。Cheng等基于(yu)脂(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)電(dian)(dian)荷(he)(he)(he)(he)在(zai)小鼠中(zhong)實現(xian)了選擇性(xing)(xing)(xing)器官靶向(xiang)(xiang)（SORT）：向(xiang)(xiang)LNP配方中(zhong)添加(jia)帶(dai)正(zheng)電(dian)(dian)荷(he)(he)(he)(he)的(de)(de)脂(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)可(ke)實現(xian)肺(fei)組織的(de)(de)優先(xian)轉染，而帶(dai)負電(dian)(dian)荷(he)(he)(he)(he)的(de)(de)脂(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)則將(jiang)轉染導向(xiang)(xiang)脾(pi)臟。

脂(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)封包可(ke)(ke)能(neng)(neng)會(hui)影(ying)響(xiang)從膜(mo)(mo)(mo)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)水(shui)化和(he)(he)變(bian)形(xing)能(neng)(neng)力到細(xi)胞攝取和(he)(he)核酸(suan)釋(shi)放等(deng)許多參數(shu)。最近的(de)(de)(de)(de)(de)(de)一(yi)(yi)(yi)篇綜述總結(jie)了形(xing)成脂(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)囊泡所需的(de)(de)(de)(de)(de)(de)脂(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)體(ti)(ti)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)基礎(chu)知識。簡單(dan)地說，每種(zhong)脂(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)都可(ke)(ke)以用(yong)一(yi)(yi)(yi)個封包參數(shu)來描述，該參數(shu)取決于脂(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)極性“頭”和(he)(he)非極性“尾”所占(zhan)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)體(ti)(ti)積。結(jie)構(gou)平衡的(de)(de)(de)(de)(de)(de)脂(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)形(xing)成柱狀(zhuang)(zhuang)(zhuang)(zhuang)結(jie)構(gou)和(he)(he)層(ceng)狀(zhuang)(zhuang)(zhuang)(zhuang)相(xiang)，而(er)“不平衡”結(jie)構(gou)則(ze)形(xing)成六方(fang)(fang)(fang)(fang)、立方(fang)(fang)(fang)(fang)和(he)(he)膠(jiao)束相(xiang)。倒(dao)置(zhi)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)六方(fang)(fang)(fang)(fang)相(xiang)（HII）表現(xian)出(chu)最顯著(zhu)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)脂(zhi)(zhi)(zhi)膜(mo)(mo)(mo)融合促(cu)進作用(yong)。到目前為(wei)止，非層(ceng)狀(zhuang)(zhuang)(zhuang)(zhuang)相(xiang)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)可(ke)(ke)控制備在(zai)RNA-LNP遞(di)送領域(yu)仍然(ran)(ran)是相(xiang)對少見的(de)(de)(de)(de)(de)(de)，納米立方(fang)(fang)(fang)(fang)液(ye)晶是最突出(chu)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)例子(zi)。然(ran)(ran)而(er)，LNPs在(zai)暴露(lu)于環境誘(you)因時(shi)(shi)可(ke)(ke)能(neng)(neng)發(fa)生結(jie)構(gou)變(bian)化。Heyes等(deng)利(li)用(yong)核磁共振波(bo)譜(pu)（P NMR）研究了含(han)有一(yi)(yi)(yi)系列具(ju)有不同(tong)脂(zhi)(zhi)(zhi)尾的(de)(de)(de)(de)(de)(de)陽離(li)子(zi)脂(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)脂(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)顆粒的(de)(de)(de)(de)(de)(de)相(xiang)變(bian)行為(wei)，發(fa)現(xian)層(ceng)狀(zhuang)(zhuang)(zhuang)(zhuang)到倒(dao)置(zhi)六方(fang)(fang)(fang)(fang)相(xiang)轉變(bian)溫度（TBH）較低的(de)(de)(de)(de)(de)(de)脂(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)具(ju)有更好的(de)(de)(de)(de)(de)(de)融合促(cu)進能(neng)(neng)力，這一(yi)(yi)(yi)點在(zai)基因沉默(mo)效率上得到了證(zheng)明(ming)。同(tong)樣，其中一(yi)(yi)(yi)個膜(mo)(mo)(mo)不穩定理論提出(chu)，當可(ke)(ke)電(dian)離(li)脂(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)暴露(lu)于晚期(qi)核內(nei)(nei)體(ti)(ti)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)酸(suan)性pH時(shi)(shi)，可(ke)(ke)電(dian)離(li)脂(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)與核內(nei)(nei)體(ti)(ti)膜(mo)(mo)(mo)內(nei)(nei)磷(lin)脂(zhi)(zhi)(zhi)之間的(de)(de)(de)(de)(de)(de)靜電(dian)相(xiang)互作用(yong)會(hui)導致膜(mo)(mo)(mo)破裂。Liu等(deng)最近的(de)(de)(de)(de)(de)(de)一(yi)(yi)(yi)項工作基于這一(yi)(yi)(yi)概念，報道了利(li)用(yong)核磁共振波(bo)譜(pu)得到的(de)(de)(de)(de)(de)(de)一(yi)(yi)(yi)種(zhong)新(xin)型可(ke)(ke)電(dian)離(li)脂(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)暴露(lu)于核內(nei)(nei)體(ti)(ti)模擬物時(shi)(shi)倒(dao)置(zhi)六方(fang)(fang)(fang)(fang)相(xiang)形(xing)成的(de)(de)(de)(de)(de)(de)證(zheng)據(ju)。雖然(ran)(ran)pH誘(you)導關聯是脂(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)材料(liao)最常見的(de)(de)(de)(de)(de)(de)機制，但在(zai)我們(men)最近的(de)(de)(de)(de)(de)(de)綜述中討論了其他導致核內(nei)(nei)體(ti)(ti)膜(mo)(mo)(mo)不穩定的(de)(de)(de)(de)(de)(de)路(lu)徑。

由于(yu)脂(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)相(xiang)和(he)整(zheng)體(ti)(ti)極性的(de)(de)(de)(de)不(bu)同，脂(zhi)(zhi)(zhi)膜(mo)可(ke)能(neng)(neng)(neng)(neng)會(hui)(hui)捕獲水(shui)(shui)(shui)(shui)從(cong)而(er)改變膜(mo)的(de)(de)(de)(de)流動(dong)性或變形性，這可(ke)能(neng)(neng)(neng)(neng)會(hui)(hui)影(ying)響脂(zhi)(zhi)(zhi)膜(mo)融合(he)。膜(mo)水(shui)(shui)(shui)(shui)合(he)作用也(ye)可(ke)能(neng)(neng)(neng)(neng)影(ying)響對(dui)pH的(de)(de)(de)(de)潛在(zai)響應，而(er)pH通(tong)常作為(wei)啟(qi)動(dong)核(he)酸釋放的(de)(de)(de)(de)一(yi)(yi)個(ge)重要環境誘因。LNP在(zai)其生(sheng)命周期中(zhong)所涉及的(de)(de)(de)(de)pH波動(dong)如圖4所示。當LNPs進(jin)入(ru)細胞內(nei)空(kong)間時，它們(men)被束縛在(zai)核(he)內(nei)體(ti)(ti)中(zhong)，而(er)核(he)內(nei)體(ti)(ti)在(zai)成(cheng)熟為(wei)溶酶體(ti)(ti)時會(hui)(hui)逐(zhu)漸酸化(hua)。因此(ci)，脂(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)膜(mo)內(nei)較(jiao)高的(de)(de)(de)(de)含水(shui)(shui)(shui)(shui)量(liang)(liang)可(ke)能(neng)(neng)(neng)(neng)會(hui)(hui)影(ying)響酸化(hua)動(dong)力學，并有加速(su)膜(mo)的(de)(de)(de)(de)失穩。Koitabashi等(deng)通(tong)過Laurdan實驗研究了siRNA-LNPs中(zhong)pH值對(dui)脂(zhi)(zhi)(zhi)膜(mo)穩定性的(de)(de)(de)(de)影(ying)響，發現膜(mo)水(shui)(shui)(shui)(shui)合(he)作用與基因沉默效率呈正相(xiang)關(guan)；然而(er)，該研究并未關(guan)注(zhu)酸化(hua)動(dong)力學。關(guan)于(yu)膜(mo)水(shui)(shui)(shui)(shui)合(he)有一(yi)(yi)個(ge)有意思的(de)(de)(de)(de)現象，核(he)磁共振(zhen)波譜結果表(biao)明，siRNA-LNPs比(bi)相(xiang)同配方的(de)(de)(de)(de)mRNA-LNPs的(de)(de)(de)(de)含水(shui)(shui)(shui)(shui)量(liang)(liang)更(geng)(geng)少，這可(ke)能(neng)(neng)(neng)(neng)是因為(wei)親水(shui)(shui)(shui)(shui)RNA鏈的(de)(de)(de)(de)長(chang)度更(geng)(geng)長(chang)。Carrasco等(deng)進(jin)一(yi)(yi)步證明了這些觀點，他們(men)發現低N/P比(bi)的(de)(de)(de)(de)KC2 LNPs單個(ge)納米(mi)顆(ke)粒中(zhong)包含更(geng)(geng)多的(de)(de)(de)(de)mRNA和(he)脂(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)，并且有較(jiao)高的(de)(de)(de)(de)介(jie)電常數，認為(wei)低N/P比(bi)的(de)(de)(de)(de)LNPs比(bi)高N/P比(bi)的(de)(de)(de)(de)LNPs更(geng)(geng)易(yi)水(shui)(shui)(shui)(shui)合(he)。更(geng)(geng)高的(de)(de)(de)(de)RNA載量(liang)(liang)也(ye)會(hui)(hui)使轉染得(de)到改善。因此(ci)，mRNA-LNPs可(ke)能(neng)(neng)(neng)(neng)對(dui)環境變化(hua)更(geng)(geng)敏感(gan)，盡管pH敏感(gan)性的(de)(de)(de)(de)變化(hua)可(ke)能(neng)(neng)(neng)(neng)與生(sheng)物(wu)過程的(de)(de)(de)(de)時間尺度無關(guan)。暴露在(zai)生(sheng)物(wu)環境中(zhong)的(de)(de)(de)(de)重組(zu)進(jin)一(yi)(yi)步使LNP殼水(shui)(shui)(shui)(shui)化(hua)的(de)(de)(de)(de)問(wen)題變得(de)復雜。

圖(tu)4 LNP生命周期中涉及的pH變化

LNPs固有的(de)(de)(de)水環境也對其(qi)長(chang)期(qi)穩(wen)定(ding)構成(cheng)威脅。純核酸(suan)在環境條件(jian)下(xia)(xia)可(ke)(ke)通(tong)過(guo)外源RNase降(jiang)解(jie)或自(zi)水解(jie)迅速(su)惡化(hua)。雖然LNPs可(ke)(ke)以(yi)(yi)保(bao)護(hu)核酸(suan)免受酶(mei)降(jiang)解(jie)，但(dan)它們(men)容(rong)易因(yin)為熱力(li)學因(yin)素（如(ru)最(zui)(zui)小化(hua)相(xiang)分離）聚集，可(ke)(ke)能(neng)(neng)導致納米顆粒融(rong)合時核酸(suan)的(de)(de)(de)丟失，最(zui)(zui)終影響轉染(ran)效率。低溫(wen)保(bao)存和(he)凍干可(ke)(ke)以(yi)(yi)保(bao)護(hu)RNA，但(dan)是(shi)(shi)(shi)冰結晶會(hui)損傷LNPs，盡管加入蔗(zhe)糖等(deng)低溫(wen)保(bao)護(hu)劑似(si)乎可(ke)(ke)以(yi)(yi)緩解(jie)這個問題。有趣的(de)(de)(de)是(shi)(shi)(shi)，LNPs可(ke)(ke)能(neng)(neng)會(hui)根據(ju)儲存條件(jian)改變優(you)先(xian)攝取(qu)其(qi)的(de)(de)(de)器官，這可(ke)(ke)能(neng)(neng)是(shi)(shi)(shi)它們(men)重(zhong)組的(de)(de)(de)結果(guo)。從實踐的(de)(de)(de)角度來看，最(zui)(zui)近開發的(de)(de)(de)針(zhen)對COVID-19的(de)(de)(de)mRNA-LNP疫(yi)苗為RNA療法(fa)創建(jian)(jian)了物(wu)流基(ji)礎設施，這可(ke)(ke)能(neng)(neng)會(hui)消除(chu)關于LNP穩(wen)定(ding)性、存儲和(he)運輸的(de)(de)(de)許多擔憂。這些(xie)疫(yi)苗擁有在冷凍溫(wen)度（-20°C）下(xia)(xia)長(chang)達6個月的(de)(de)(de)以(yi)(yi)及室溫(wen)下(xia)(xia)長(chang)達30天的(de)(de)(de)長(chang)期(qi)穩(wen)定(ding)性，極大(da)地推(tui)動了這些(xie)突破性治療的(de)(de)(de)普及。值(zhi)得注意(yi)的(de)(de)(de)是(shi)(shi)(shi)，輝瑞/BioNTech和(he)Moderna疫(yi)苗有著不(bu)同的(de)(de)(de)存儲要求，這表明LNP配方(fang)(fang)的(de)(de)(de)變化(hua)可(ke)(ke)能(neng)(neng)會(hui)顯著改變其(qi)核酸(suan)親和(he)力(li)和(he)LNP穩(wen)定(ding)性。由于目前還沒(mei)有建(jian)(jian)立(li)針(zhen)對這些(xie)非晶材料(liao)的(de)(de)(de)加速(su)穩(wen)定(ding)性測試的(de)(de)(de)方(fang)(fang)法(fa)，這意(yi)味著，LNP穩(wen)定(ding)性只能(neng)(neng)在離散時間點進行經驗(yan)評估，差示掃描量熱法(fa)（DSC）等(deng)方(fang)(fang)法(fa)可(ke)(ke)能(neng)(neng)對LNP退(tui)化(hua)提(ti)供有價值(zhi)的(de)(de)(de)參考(kao)。最(zui)(zui)后，預測基(ji)于LNP的(de)(de)(de)RNA療法(fa)的(de)(de)(de)下(xia)(xia)游特性需(xu)要我們(men)對LNP的(de)(de)(de)自(zi)組裝過(guo)程有更深的(de)(de)(de)理(li)解(jie)。

圖5 LNP結構待解決(jue)問題(ti)

5.結論和(he)展望

LNPs是(shi)一種高(gao)度(du)可(ke)定制的(de)(de)核(he)酸(suan)載體(ti)，在(zai)mRNA疫苗中顯示出巨(ju)大的(de)(de)潛(qian)力。我們也不(bu)應忽視它們在(zai)治(zhi)療罕見疾病和癌癥方面的(de)(de)可(ke)能(neng)(neng)價值。mRNA治(zhi)療可(ke)以幫(bang)助產生治(zhi)療性蛋白來(lai)恢(hui)復受損組(zu)織(zhi)或器官(guan)的(de)(de)功能(neng)(neng)。全球(qiu)開展了大量(liang)的(de)(de)科(ke)學(xue)研究來(lai)設計和細(xi)化LNPs的(de)(de)單(dan)個成分，以便高(gao)效和安(an)全地遞送(song)所關注的(de)(de)核(he)酸(suan)。然而(er)，LNP科(ke)學(xue)方興未艾，還有許多懸(xuan)而(er)未決的(de)(de)問題，圖5中列出了其中的(de)(de)一些。毫(hao)無疑問，公眾對mRNA疫苗的(de)(de)持續高(gao)漲的(de)(de)興趣將激勵這一領域的(de)(de)研究工作，我們謹慎樂觀地認(ren)為(wei)，我們正在(zai)見證納(na)米醫學(xue)的(de)(de)新(xin)時(shi)代。

原文(wen)來源：Chemistry of Lipid Nanoparticles for RNA Delivery.Acc Chem Res. 2022 Jan 4;55(1):2-12.